微波水热法制备氧化镁-氧化铜-氧化钙复合材料及其抗菌性能

田其哲，叶俊伟，2，宁桂玲，2

（1.大连理工大学化工学院，精细化工国家重点实验室，辽宁大连116024；2.辽宁省硼镁特种功能材料制备与应用技术工程实验室）

设计合成具有高效、广谱、稳定、持久、低毒等特点的抗菌材料是当前研究的热点［1-3］。目前普遍使用的抗菌材料按照组成主要分为有机抗菌剂、 无机抗菌剂、高分子抗菌剂以及天然抗菌剂等几大类［4］。常见的有机抗菌剂如苯酚类、双胍类、季铵盐、异噻唑类、咪唑类、细菌素和酶已经被广泛研究，但是由于其很多组分使用条件苛刻、耐热性差、易产生耐药性等缺点限制了其应用。与有机抗菌剂相比，无机抗菌剂展现了稳定性好、抗菌广谱、不产生耐药性等优点，纳米级金属氧化物如ZnO［5］、Cu2O［6］、CeO2［7］、MgO［8-9］、CuO［10］和CaO［11］等吸引了研究者的极大关注，并且展现了良好的应用前景。

纳米氧化镁是一种重要的无机化工原料， 在催化［12］、光 学［13］、医 疗［14］、吸 附［15］等 领 域 有 重 要 的 应用。 氧化镁不但原料易得、生物相容性好，而且可以通过活性氧（ROS）氧化损伤、吸附作用带来的机械损伤［16］有效地破坏细胞膜结构从而抑制细菌生长或者杀死细菌，展现了广谱抗菌活性和抗菌性能持久性，成为一种有巨大应用潜力的无机抗菌材料［17］。 目前关于纳米氧化镁的研究多集中在氧化镁抗菌机理和制备方法研究领域。 例如Makhluf 等［18］利用微波水热技术制备了纳米MgO， 发现MgO 的抗菌性能具有依赖尺寸效应；Anicic 等［19］探究了MgO 表面缺陷对抗菌活性和ROS 生成潜力的作用，发现MgO 表面与细菌壁之间的酸碱反应对MgO 的抗菌活性有重要的影响。 笔者课题组也报道了气溶胶法制备氧化镁及其吸附和抗菌性质［20］。 虽然多种制备方法被用于氧化镁的制备，但是制备的氧化镁材料的最小抑菌浓度（MIC）值仍然较大，抗菌活性需要进一步提升。

多组分协同抗菌是提升材料抗菌性能的重要途经［21-22］，二元金属氧化物复合材料吸引了人们的研究兴趣，如Hong 等［23］采用电沉积法合成了具有较高抗菌活性和光催化活性的Cu2O-ZnO 复合膜，在荧光条件下50min 后对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的抑菌率分别达到90.23%和88.78%；Karthik等［24］通过超声辅助法合成了CdO-MgO 纳米复合材料， 该材料展现出对食源性病原体很强的抗菌活性。 笔者采用微波水热法制备不同比例的MgOCuO-CaO 复合材料，通过XRD、SEM、BET 等技术表征了材料结构，对不同比例复合金属氧化物的抗菌活性进行了研究。

1 实验部分

1.1 试剂

六水氯化镁（MgCl2·6H2O）、二水氯化铜（CuCl2·2H2O）、无水氯化钙（CaCl2）、十六烷基三甲基溴化铵（C19H42BrN，CTAB）、氯化钠、琼脂、蛋白胨、酵母粉，均为分析纯化学试剂。

1.2 MgO-CuO-CaO 复合材料的制备

取2.5g CTAB 加入25mL 去离子水，在室温下磁力搅拌30min，滴加80mL 浓度为0.8mol/L 的MgCl2、CuCl2、CaCl2混合溶液（Mg2+、Cu2+、Ca2+浓度比分别为1∶0∶0、8∶1∶1、7∶2∶1、7∶1∶2），继续搅拌30min，之后逐滴滴加160mL 浓度为0.8mol/L 的NaOH 溶液， 搅拌120min。将反应后的悬浊液置于微波水热反应釜中于180℃反应30min，取出样品用乙醇、纯净水滤洗3遍，将过滤后的沉淀置于60℃烘箱中干燥12h。 最后将干燥后的产物在600℃煅烧2h。得到的样品分别 命 名 为MgO、MgO0.8CuO0.1CaO0.1、MgO0.7CuO0.2CaO0.1、MgO0.7CuO0.1CaO0.2。

1.3 样品表征

使用X 射线衍射仪（Smart Lab 9）表征样品的结构；通过扫描电子显微镜（Quanta 450）对MgO-CuOCaO 的结构形貌进行分析；在氮吸附分析仪（Autosorb iQ-C/C-XR） 上测定样品的N2吸附-脱附等温线，同时通过BET 方法和BJH 模型计算样品的比表面积、孔容和平均孔径；利用酶标仪（Epoch2TM）测量样品的光密度（OD）。

1.4 抗菌性能测试

1.4.1 MIC 抗菌测试

选取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为抗菌实验模型菌。将细菌加入到25mL 配制好的液体培养基中，放入恒温摇床中培养12h 成为细菌原液。 在无菌试管中加入一定比例的液体培养基和抗菌材料并超声分散，配制出不同浓度梯度的样品溶液（500、600、700μg/mL），向每个试管中加入50μL 细菌原液。将试管放入恒温摇床中进行培养， 每隔2h 取上清液100μL 加入96孔板中，利用酶标仪测试其OD600值，得到不同浓度样品作用下的细菌生长情况。

1.4.2 菌落计数法

将培养16h 的细菌原液取出5μL，加入到适量液体培养基中稀释至OD600为0.01备用。在24孔板中配制2mL 不同浓度的药品溶液，并加入50μL 稀释后的细菌原液。 将24孔板放入37℃的细胞培养箱中培养2h，取出50μL 在固体培养基的表面均匀涂抹。再将培养皿放在细胞培养箱中培养24h，取出观察菌落生长情况，并计算培养基上的菌落数量，最后得出细菌抑菌率：

式中：X 为样品的抑菌率；Ncontrol为空白样品所在培养基上的菌落数；Nsample为制备的样品所在培养基上的菌落数。

2 结果与讨论

图1为不同比例MgO-CuO-CaO 复合物的制备流程图。 CTAB 分散剂的作用是可以吸附在沉淀表面，减小表面的位阻，避免晶粒团聚，从而更容易合成粒径较小的产物。实验中采用了微波水热技术，微波水热的优点是能够在短时间内促进反应生成多种金属离子混合的氢氧化物前驱体， 同时微波水热的热量是从内部往外部扩散，可以进行快速均匀加热，从而既能制备出超细MgO 复合粉末，又能避免传统制备方法容易造成颗粒团聚的问题。 这种方法能够高效制备大批量的精细产品的同时，消耗能量很少。

图1 不同比例MgO-CuO-CaO 复合物制备流程图

图2为制备的不同比例MgO-CuO-CaO 复合物的XRD 谱图。 从图2发现，制备的不同比例MgOCuO-CaO 复合物均具有MgO 特征衍射峰，在2θ 为36.94、42.92、62.30、74.69、78.63°处的衍射峰与方镁石结构标准卡片（JCPDS 87-0653）的（111）（200）（220）（311）（222）晶面相对应；在MgO0.8CuO0.1CaO0.1样品XRD 谱图中出现CuO 和CaO 衍射峰，由于复合的比例较小，因此峰强较弱；随着CuO 和CaO 含量不断提升，MgO0.7CuO0.2CaO0.1在2θ 为33.23、35.24、38.47、48.59、53.32、58.05、61.34、65.89、67.85°等 处 出 现 较强的CuO 衍射峰，分别对应CuO（JCPDS 45-0937）的（110）（002）（111）（202）（020）（202）（113）（022）（113）晶面；MgO0.7CuO0.1CaO0.2在2θ 为29.76、35.60、39.49、47.57、48.38°等处的衍射峰与CaO（JCPDS 28-0775）的（111）（200）（220）（311）（222）晶面相对应。由谢乐公式计算可以得到MgO、MgO0.8CuO0.1CaO0.1、MgO0.7CuO0.2CaO0.1、MgO0.7CuO0.1CaO0.2的 晶 粒 大 小 分别为20.40、27.02、29.32、13.71nm。 晶粒越小与细菌微生物接触损伤的程度越大， 这在之后的抗菌性能测试实验中也得到了体现。 同时在4个样品的XRD谱图上均未发现其余的杂峰， 这说明成功制备出MgO-CuO-CaO 三元金属氧化物复合物， 产物的结晶情况与金属氧化物的比例有较大的关系。

图2 制备的不同比例MgO-CuO-CaO 复合物的XRD 谱图

图3为制备的不同比例MgO-CuO-CaO 复合物的SEM 照片。 从图3看出， 制备的样品均为100～200nm 的片状晶粒堆积而成，其中氧化镁的纳米片直径在150nm 左右； 随着复合物中CuO 比例的增加，样品的片状形貌没有较大改变，但是颗粒的大小有所下降，MgO0.7CuO0.1CaO0.2的直径在100nm 左右。随着CaO 比例的增大，产物之间成为更加薄的片状结构，锋利的边缘更加容易破坏细菌的细胞壁，增加机械损伤的可能性，有助于提高产物的抗菌活性。

图3 制备的不同比例MgO-CuO-CaO 复合物的SEM 照片

图4为制备的不同比例MgO-CuO-CaO 复合物的氮吸附-脱附等温线以及其孔径分布曲线。 由国际纯粹与应用化学联合会2015年最新标准来看，制备的样品的吸附等温线均与Ⅳ型相符， 滞后环与H3型相符，表明样品均为层状堆积的介孔结构。由BET法 和BJH 模 型 计 算 可 知MgO、MgO0.8CuO0.1CaO0.1、MgO0.7CuO0.2CaO0.1、MgO0.7CuO0.1CaO0.2的 比 表 面 积 分别 为45.243、24.822、20.968、66.789m2/g，孔 容 分 别为0.6237、0.1735、0.0752、0.9036cm3/（g·nm），平均孔径为54.945、27.958、14.343、54.117nm。 可见随着CuO 复合比例的不断增加，样品的比表面积、孔容、平均孔径均明显减小，而随着CaO 比例的增加，样品比表面积、孔容、平均孔径均先减小后增加，这可能是由于Cu2+的离子半径（0.073nm）与Mg2+的离子半径（0.072nm）十分接近，造成部分Cu2+进入MgO 表面空穴，导致比表面积减小，而Ca2+的离子半径（0.1nm）要大于Mg2+的离子半径， 两者的金属氧化物在结晶的过程中相互影响较小，更容易复合在一起。当CaO 的物质的量比例达到0.2时，MgO0.7CuO0.1CaO0.2较纯氧化镁的比表面积和孔容有明显提升，这有利于样品在液体环境下吸附水中的细菌，从而更有效地除去水中的微生物。

图4 制备的不同比例MgO-CuO-CaO 复合物的氮吸附-脱附曲线和孔径分布曲线

为直观地比较各个样品的抗菌性能， 将大肠杆菌和金黄葡萄球菌与质量浓度为500μg/mL 的样品作用后的生长趋势分别做成曲线图，结果见图5。 由图5看出， 所有样品对大肠杆菌普遍具有明显的抑制效果，而对于金黄葡萄球菌的抑菌效果相对较差。其中MgO0.7CuO0.1CaO0.2的抗菌效果表现优异， 无论针对大肠杆菌还是金黄葡萄球菌均具有出色的抑菌作用，在24h 内能够有效地控制细菌的生长繁殖在一个很低的水平，最小抑菌浓度（MIC）可以达到500μg/mL，但是MgO0.8CuO0.1CaO0.1、MgO0.7CuO0.2CaO0.1的抗菌活性与纯MgO 相比没有得到有效提升，与之前的一系列相关表征测试结果相一致。 分析原因是氧化镁的表面缺陷能够形成大量的氧空位， 可以生成较多的O2-和·OH 等ROS，这些活性物质在碱性环境下能够更稳定地存在， 由于Cu2+与Mg2+的离子半径接近，Cu2+容易堵塞氧化镁表面的空穴，导致产物的比表面积降低，ROS 的生成量减少，而CaO 在水中容易水解，这能够提供一个碱性更强的液体环境，有利于ROS 的生成和稳定存在。 另外MgO0.7CuO0.1CaO0.2更薄的片状结构和较大的比表面积更容易对细菌造成机械损伤。 由此可见金属氧化物的比例会影响产物的物化性质，从而对抗菌活性有关键的作用。

图5 大肠杆菌（a）和金黄葡萄球菌（b）在500μL/mL 浓度下与不同比例MgO-CuO-CaO 复合物作用后的生长曲线图

利用菌落计数法研究了不同浓度样品的抗菌性能。 配制了质量浓度为500、600、700μg/mL 的MgO0.7CuO0.1CaO0.2悬浊液来处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，通过24h 后的菌落计数来测试其抗菌性能，结果见图6。 由图6可以看出MgO0.7CuO0.1CaO0.2在3个浓度下均显示出良好的抑菌效果， 当其质量浓度为500μg/mL 时对大肠杆菌的抑菌率为95.5%，对金黄葡萄球菌的抑菌率为91.5%；在其质量浓度为600μg/mL 和700μg/mL 时对两种细菌的抑菌率均达到99.9%以上。 MIC 法和菌落计数法均展现出样品对于大肠杆菌的抑菌效果要优于金黄葡萄球菌，这可能是由于大肠杆菌的细胞壁较薄，对环境比较敏感，容易造成大肠杆菌生物膜的机械损伤；另一方面样品生成释放出的ROS 能使生物膜发生脂质过氧化反应， 较薄的细胞壁使得这些物质更容易进入大肠杆菌内部对DNA 和蛋白质产生氧化损伤，从而起到杀死细菌的作用。

图6 不同浓度下MgO0.7CuO0.1CaO0.2 与大肠杆菌和金黄葡萄球菌作用后的菌落生长情况（a）和抑菌率柱状图（b）

3 结论

采用微波水热法制备了不同比例的MgOCuO-CaO 复合材料。 制备的MgO-CuO-CaO 复合材料由纳米片状晶粒组成。 BET 测试结果表明MgO0.7CuO0.1CaO0.2具有高的比表面积和孔容，分别为66.789m2/g 和0.904cm3/（g·nm），平 均 孔 径 为54.117nm，这有利于其在液体环境下吸附细菌等微生物。 抗菌实验结果表明，MgO0.7CuO0.1CaO0.2展现出高的抗菌活性， 当其质量浓度为500μg/mL 时对大肠杆菌的抑菌效果优于对金黄葡萄球菌的抑制作用， 在其质量浓度为600μg/mL 时对两种细菌的抑菌率均能达到99.9%以上。 该研究结果对于制备复合抗菌材料有重要的意义， 制备的材料在抗菌领域具有良好的应用前景。