类乌齐牦牛RNF216基因的克隆及组织表达分析

陈 美，柴志欣，武志娟，王 会，王吉坤，王嘉博，钟金城*，信金伟

(1.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省、教育部重点实验室，四川 成都 610041；2.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，西藏 拉萨 850000)

【研究意义】牦牛(Bosgrunniens)是我国青藏高原的特有畜种，能充分利用高寒高山草原进行动物性生产的优势牛种[1]，主要分布在青海、西藏、四川、甘肃、云南、新疆及内蒙古等地区[2]。西藏自治区由于特殊的地理特征和生态环境形成了许多地方牦牛品种或类群，牦牛遗传资源十分丰富[3]。牦牛是西藏畜牧业经济不可缺少的畜种，牦牛业在自治区畜牧业发展中占有十分重要的地位。类乌齐牦牛主要分布在西藏自治区的昌都市类乌齐县境内海拔4500 m以上的高山草甸草原地区，属以产肉为主肉乳兼用型牦牛。中心产区为类乌齐镇、卡玛多乡、长毛岭乡和吉多乡等乡镇，是经长期自然选择而形成的能适应当地生态环境的优良牦牛遗传资源，类乌齐牦牛肉也因肉质鲜美，天然无公害，具有高蛋白质和矿物质含量，低脂肪、低能量、氨基酸含量丰富等特点[4-5]，深受当地农牧民的喜爱，也成为其增产增收的主要来源之一。环指蛋白216抗体(ring finger protein 216，RNF216)，也称含三联域蛋白3(Triad3A)、泛素偶联酶7-相互作用蛋白1或锌指蛋白抑制NF-kappa-B(ZIN)，是E3泛素连接酶的RING家族的一员，在其N末端包含一个锌指结构域，C末端包含一个环指结构域。RNF216是含有RING结构域的E3泛素连接酶，在巨噬细胞、乳腺癌细胞、性腺发育以及肥胖等生物过程中均发挥一定作用[6-7]。【前人研究进展】Santens等[8]在人常染色体隐性遗传疾病中发现RNF216突变可能导致Gordon Holmes综合征，即一种以性腺功能低下和小脑共济失调为特征的疾病，以及常染色体隐性遗传性亨廷顿样疾病；黄施倩等[7]采用野生型(WT)和RNF216基因缺陷型(RNF216-/-)小鼠，使用EO771乳腺癌细胞建立乳腺癌移植瘤模型，观察小鼠乳腺癌细胞的成瘤情况，确定RNF216可通过调控Th1型免疫应答参与肿瘤的发生；Xu等[9]在人的自噬细胞中发现RNF216有强烈抑制巨噬细胞自噬的作用，RNF216与自噬作用中的关键调节因子BECN1相互作用，使BECN1泛素化，从而导致BECN1降解，且RNF216通过与三联体(两个RING和DRIL)结构域直接相互作用参与BECN1赖氨酸48的泛素化等过程；Wang等[10]发现RNF216在人结肠直肠癌(CRC)组织和细胞中有调节功能，并与CRC的进展相关。Goyenechea等[11]选择两组肥胖受试者，通过qRT-PCR在3个时间点(第0周，第8周和第32周)评估外周血单核细胞(PBMC)中RIPK3和RNF216的身体组成和mRNA水平，发现肥胖受试者在接受低热量饮食(LCD)的过程中，体重会明显减轻，且这些基因的mRNA水平可用于预测肥胖症治疗结果的营养基因组生物标志物。常染色体隐性遗传疾病的发生，涉及RNF216，OTUD4和STUB1的泛素化及基因的编码突变，如Jonatha等[12]对CHIP-/-小鼠的运动缺陷进行了表型分析，在STUB1突变患者中观察到性腺机能减退，说明RNF216突变患者也出现相同现象，且通过透射电子显微镜对骨骼肌进行观察，发现CHIP -/-小鼠具有形态学变化，其与股四头肌和肌肉痉挛的肌浆网室增加一致腓肠肌(有毒低聚物和管状聚集体)有关，说明CHIP与常见的肌肉和心脏疾病具有相关性。【本研究切入点】以上研究显示，RNF216除在人的疾病中发挥作用外，其在肥胖或者肌肉相关疾病等方面也发挥作用。目前，针对RNF216基因的相关研究主要集中于人和小鼠，【拟解决的关键问题】本研究选取类乌齐牦牛通过克隆获得RNF216基因的cDNA序列，并利用荧光定量PCR方法检测该基因在不同组织器官中的表达情况，为牦牛的肌肉发育分子调控机制提供重要理论依据，以期为优化牦牛选育体系提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样本采集 于西藏自治区昌都市类乌齐县选取3头健康的0.5岁龄类乌齐牦牛，采集其肝脏、肺脏、心脏、脾脏、臀脂和臀肌等组织，DEPC水冲洗干净后，锡箔纸包装迅速置于液氮中保存备用。

1.1.2 实验试剂 YBR Premix ExTaqTMⅡ、PrimeScriptTMRtreagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)RNA 反转录试剂盒、pGEM-T Vector cloning kit、DH5α感受态细胞、2000 bp Marker和TB Green Premix ExTaqII (TaKaRa公司)；组织RNA提取试剂TRIzol(美国 Invitrogen公司)；DNA 纯化回收试剂盒(北京 天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中公布的黄牛RNF216基因mRNA序列(NM_001193258.1)，利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物(表1)；将克隆获得的类乌齐牦牛CDS区序列用于设计荧光定量PCR引物，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.2.2 组织总RNA提取及cDNA链的合成 采用Trizol法提取组织总RNA，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA样品的完整性，分光光度计测定 RNA浓度及D260nm/D280nm值。按照反转录试剂盒说明书将其反转录成cDNA，置于-20 ℃保存。

1.2.3RNF216基因克隆与测序 PCR扩增体系(25 μl)：2×TaqGreen PCRMasterMix 12.5 μl，上、下游引物各1 μl， cDNA模板1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。将PCR扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测其条带清晰度及完整性，利用DNA纯化试剂盒进行纯化回收，将纯化回收后的目的片段与pGEM-T载体在16 ℃的条件下连接过夜，后转化到 DH5α感受态细胞(大肠杆菌)中冰浴30 min，取出于超净工作台中，加入900 μl不含Amp+的无菌LB培养液，在37 ℃、150 r/min的摇床中培养45 min，复苏后将其涂布于含有Amp+的LB培养基上，37 ℃倒置培养10～14 h，挑取合适的克隆菌置于含Amp+的LB培养液中37 ℃、180～200 r/min震荡培养10～12 h，经菌液PCR鉴定后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

表1 引物序列

1.2.4 荧光定量PCR检测 将克隆得到的RNF216基因目的片段进行拼接，用于设计实时荧光定量特异性引物。以GAPDH为内参基因，cDNA为模板，进行牦牛组织的荧光定量PCR，分析RNF216基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、臀脂和臀肌等组织的相对表达量。反应体系(10 μl):SYBR Premix ExTaqTM(2×)5 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 3.2 μl。反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，共39个循环。用 2-ΔΔCt法计算各个样本的相对表达量，利用SPSS 19.0软件进行显著性分析。

1.2.5RNF216基因序列的生物信息学分析 利用NCBI中ORF Finder程序分析牦牛RNF216基因开放阅读框；ExPASy中ProtParam预测其蛋白分子质量、氨基酸组成、亲水性等理化性质；NetPhos预测蛋白磷酸化位点；TMHMM、PSORT II和SignaLP分别预测其蛋白的跨膜结构、信号肽和亚细胞定位；SOPMA及SWISS MODEL预测蛋白的二级、三级结构；Clustal X和MEGA软件分析基因序列一致性并构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 牦牛RNF216基因PCR扩增结果

按照克隆引物序列，以牦牛肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，其扩增条带清晰单一，分别为500、1262和1242 bp，与预期扩增片段大小吻合(图1)。

利用NCBI中ORF Finder在线程序对克隆得到的牦牛RNF216基因序列进行开放性阅读框分析，获得RNF216基因CDS区序列长为2223 bp，共编码740个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA(图2)。

2.2 牦牛RNF216基因的理化性质分析

利用ExPASy在线软件分析类乌齐牦牛 RNF216 蛋白质序列的理化性质。结果显示，共编码740个氨基酸，其中Glu含量最多(10.8 %)，不含Pyl和Sec。负电荷残基总数(Asp + Glu)134个，正电残基总数(Arg + Lys)82个。该蛋白分子式为C3710H5721N1019O1172S45，其分子量为84 785.06 D，原子总数11 667，理论等电点PI为4.79，亲水性平均值(GRAV)为-0.722，脂肪指数为68.19，不稳定指数(II)为60.19，说明该蛋白为不稳定亲水酸性蛋白。

图2 牦牛RNF216基因编码的蛋白序列Fig.2 Protein sequence encoded by the yak RNF216 gene

2.3 牦牛RNF216蛋白的亲水性/疏水性及亚细胞定位预测

利用Expasy中Prot Scale程序分析RNF216蛋白疏水性/亲水性，发现信号蛋白的最小值为-3.300，位点位于432位，其亲水性最强；最大值为1.967，位点位于322位，其疏水性最强(图3)，说明此蛋白为亲水性蛋白。利用PSORTII Prediction 在线软件进行牦牛RNF216蛋白的亚细胞定位，发现该蛋白在细胞核中的分布最多，高达91.3 %；在囊泡和细胞骨架内分布较少，均为4.3 %。

正值表示疏水；负值表示亲水 Positive values indicate hydrophobicity; negative values indicate hydrophilic图3 牦牛RNF216蛋白的疏水性/亲水性预测Fig.3 Hydrophobic/hydrophilic prediction of RNF216 protein in yak

2.4 牦牛RNF216基因编码蛋白跨膜区与信号肽预测

采用TMHMM在线软件分析RNF216基因编码蛋白跨膜区，发现类乌齐牦牛RNF216蛋白不存在跨膜区域，不属于膜上受体或无法定位于细胞膜上，说明该蛋白质非跨膜蛋白。

SignalP在线分析发现RNF216蛋白无信号肽区域，说明RNF216属非分泌蛋白。

2.5 牦牛RNF216蛋白磷酸化分析

运用Net Phos2.0软件对RNF216蛋白磷酸化位点进行预测，发现牦牛RNF216基因编码的氨基酸中共发现24个丝氨酸(Ser)、8个苏氨酸(Thr)和9个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点(图4)。

2.6 牦牛RNF216二级结构和三级结构预测

采用SOPMA在线软件对牦牛RNF216蛋白二级结构进行预测，RNF216蛋白主要结构为无规卷曲和α-螺旋，分别占总链48.11 %和41.32 %；延伸链和β-转角，分别占总链的7.74 %和2.83 %(图5)。SWISS-MODEL软件预测RNF216蛋白三级结构，发现该蛋白是基于ARIH1原子结构5tte.1的A链进行模建，两者序列一致性可达25.13 %。

图4 牦牛RNF216蛋白磷酸化分析Fig.4 Phosphorylation analysis of RNF216 protein in yak

图5 牦牛RNF216蛋白二级结构预测Fig.5 Prediction of secondary structure of RNF216 protein in yak

图6 牦牛RNF216蛋白三级结构预测Fig.6 Prediction of tertiary structure of RNF216 protein in yak

2.7 物种一致性比较与系统进化树分析

利用Lasergene软件中MegAlign程序对类乌齐牦牛RNF216基因CDS区序列和其他物种该基因的CDS进行比对，并用MEGA.5软件构建系统进化树。由表3可知，类乌齐牦牛RNF216基因序列与GenBank中黄牛、白海豚、猪的序列一致性较高，分别为93.5 %、91.3 %和90.3 %；与人和鼠类的一致性较低。依据牦牛RNF216基因构建进化树，发现牦牛与黄牛的遗传距离最近，与鼠类亲缘关系最远，符合物种进化规律(图7)。

表2 牦牛与12个物种RNF216基因的序列同源性比对

图7 牦牛RF216基因的系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree of RF216 gene in yak

图8 牦牛RNF216基因的mRNA组织表达分析Fig.8 mRNA expression analysis of RNF216 gene in yak

2.8 牦牛RNF216基因不同组织差异表达分析

以GAPDH基因为内参基因，利用实时荧光定量PCR对类乌齐牦牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、臀肌和臀脂等组织进行差异分析，发现牦牛RNF216基因在以上组织中均有表达 (图8)，其中在肺脏中的表达水平最高，其次是脾脏，在臀肌的表达水平最低。

3 讨 论

中国是世界上牦牛遗传资源最多的国家，虽牦牛生长在高寒地区，肌纤维较粗，肉质嫩度中，较其它品种牛肉属于中等偏韧[13-14]，但牦牛肉是西藏自治区特有的肉类资源，富含丰富的蛋白质和氨基酸，从而受到广大消费者青睐[15]。因此，随着人们生活水平不断提高，提高牦牛肉品质及产量成为研究的热点之一，近年来，国内众多学者在提高牦牛生产性能研究的基础上开始对其肉质性状进行研究和开发[16]。通过筛选影响牦牛肉品质及产肉量的关键基因，并对其进行定量表达分析成为目前研究基础。

RNF216是一种RBR型E3泛素蛋白连接酶，其与TLR的Toll /白细胞介素-1受体结构域相互作用并促进其蛋白水解降解[17-18]。研究表明，通过RNF216上调可抑制TLR4表达，而TLR4的异常激活在肥胖诱导的炎症中具有关键作用，且与高胰岛素血症、高甘油三酯血症和心血管疾病等疾病相关[19]，说明RNF216可能与脂肪和糖代谢相关。RNF216在自噬中也发挥重要作用，自噬是细胞稳态的基础[10]。它还控制受体相互作用蛋白1(RIP1)的泛素化和蛋白酶体降解，RIP1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在Hsp90结合被破坏后，该蛋白激酶与肿瘤坏死因子受体1(TNF-R1)诱导的NF-kappa B活化密切相关[20-21]。此外，RNF216与人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒粒子感染因子(Vif)蛋白相互作用，而Vif蛋白对初级人类CD4T淋巴细胞和巨噬细胞的生产性感染至关重要[22]。

本研究成功克隆了类乌齐牦牛RNF216基因的CDS区序列，对亚细胞定位进行分析，发现RNF216基因编码蛋白主要存在细胞核中，而细胞核是遗传物质储存和复制的场所及细胞遗传性和细胞代谢活动的控制中心，说明RNF216蛋白可能参与细胞内的代谢调控，且在维持细胞脂质稳态等方面发挥一定作用[23]。对牦牛RNF216蛋白进行磷酸化分析，发现存在24个丝氨酸、8个苏氨酸和9个酪氨酸磷酸化位点，其中丝氨酸位点的数量最多，而丝氨酸在脂肪和脂肪酸新陈代谢及肌肉生长过程中发挥作用，并在肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成等过程均发挥作用，推测RNF216基因可能在类乌齐牦牛的脂肪代谢和肌肉生长过程中发挥一定作用，接下来我们将进一步开展该基因功能的相关研究。因RNF216基因在核苷酸和氨基酸序列中与哺乳动物的一致性较高，同时类乌齐牦牛RNF216与黄牛的遗传距离最近，并与鼠类遗传距离较远，说明该基因在进化过程中保守性强。

运用qPCR 技术检测牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、臀肌和臀脂等组织中RNF216基因的表达情况，发现该基因在肺脏中的表达水平最高，其次是脾脏，然后是臀脂，而在臀肌中的表达水平最低，根据以上研究结果可知RNF216基因主要在牦牛肺脏组织中作用，而肺作为机体重要的呼吸器官，牦牛主要生活在海波3500 m以上的高寒草场，具有耐低氧、寒冷、强紫外线等优良特性，推测该基因在牦牛低氧适应性的生理特性中发挥一定调控作用。牛肉感官品质的指标包括牛肉色泽、肌肉内脂肪含量及肉质柔韧性等[24]，而肌内脂肪(IMF)含量是影响肉质的主要因素[25]，牛肉肌肉内的脂肪含量越高，肉质越是滑嫩，品质也越好。而牦牛肌肉蛋白质含量高，而脂肪含量非常低。本研究表明，牦牛RNF216基因在臀脂中的表达水平也较高，且在臀肌中也有分布，推测该基因在牦牛的肌肉脂肪发育过程中也发挥一定的作用。

4 结 论

本研究成功克隆了牦牛RNF216基因的CDS序列，编码 740 个氨基酸残基。该基因编码蛋白不存在信号肽和跨膜结构，为不稳定亲水酸性蛋白，主要分布在细胞核中。牦牛RNF216蛋白存在 24个丝氨酸、8个苏氨酸和9个酪氨酸磷酸化位点。其与黄牛的遗传距离是最近，与鼠类的遗传距离最远，RNF216基因在肺脏组织中的表达水平最高。