紫色土塘泥微生物群落季节变化及其与环境因子的关系

李天才，赵晴云，江 瑞，付 梅，苏胜齐*

(1.西南大学动物科技学院，重庆 400700；2.西南大学渔业资源环境研究中心，重庆 400700；3.雅砻江流域水电开发有限公司，四川 成都 610000)

【研究意义】随着渔业养殖集约化程度的不断提升，高密度投饲精养池塘中残饵粪便在塘泥中持续累积使得营养物质不断升高[1-2]，最终造成水体富营养化、氨氮中毒、疾病爆发等系列养殖生态系统健康问题也越来越显著[3]。采用药物对塘泥进行改良、改造只是暂时性措施，生态调节才是解决问题的可持续手段。因此，研究池塘生态系统中塘泥微生物群落特征具有非常重要的意义。【前人研究进展】塘泥微生物不仅是池塘生态系统的组成部分，也是生态修复的功能菌库[4]，其在生长繁殖过程可消耗有机质，同时产生的多种酶是有机质分解的催化剂[5]，甚至可直接同化或降解有毒、有害物质[6]。塘泥微生物虽对环境修复有积极作用，但也常常是水产品的病原菌或条件致病原库[4]，甚至部分种类会直接降低水产品品质[7]，在水产养殖中占据着特殊的地位。紫色土形态独特，肥力丰富，是我国重要的农业土壤资源[8]。四川盆地集中分布着我国51.53 %面积的紫色土[8]，其中四川盆地中的川渝地区是我国重要的池塘养殖区域，池塘的建造基本以紫色土为基础。目前关于紫色土的研究多集中于肥力、水土保持等方面[9-11]，而对紫色土池塘生态系统的研究目前较少。【本研究切入点】本试验以蓬莱镇组微碱性紫色土为底质模拟紫色土池塘养殖过程，测定春、夏和秋季塘泥环境因子，鉴定塘泥微生物种类，旨在解析紫色土塘泥微生物群落特征及其与环境因子之间的关系。【拟解决的关键问题】为紫色土池塘“泥—水”相调控提供依据和指导，同时为深入开展不同紫色土的宜渔性评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验系统构造

试验用紫色土取自大足区重庆市大足区(N 29.7264°，E 105.9689°)，分类上属蓬莱镇组(J3s)，取土时将表层土壤刨去，挖取风化而未经耕作的0～20 cm土壤。把50 kg紫色土转入不透明水族缸(竖切面为梯形，r1= 30 cm，r2= 40 cm，h=80 cm)中，加入曝气自来水，土水比为1∶5[12]，土层厚12 cm[13]，覆水60 cm。每缸放养全长(69.7±1.2) mm的湘云鲫7尾[14][尾均重为(9.57±0.08) g]，每天投喂3 %体重饲料，设置3个重复，水族缸充氧，每月22日换水1/3。系统设置在室外有顶通风平台下。试验进行时间为2016年4月10日至9月22日，为期160 d，分别于5月22日、7月22日、9月22日使用柱状采泥器收集塘泥样本，将原始紫色土和试验收集的3组样品分别编号为S0、春、夏和秋。

1.2 塘泥环境因子测定方法[15]

温度：每天傍晚直接用温度计测定塘泥温度；pH：水土比为2.5∶1混合后使用phs-3c型pH计测量；氧化还原电位(O.R.P)：塘泥样本取出后迅速用O.R.P计直接测量。

取回的塘泥先阴干，之后进行碾磨并过0.25 mm筛网，收集100 g塘泥粉末用于测定营养成分。有机质、TN、TP、TK分别采用重铬酸钾法、重铬酸钾-硫酸消化法、氢氧化钠碱熔-钼锑抗比色法、火焰光度法进行测定。

1.3 塘泥微生物培养与鉴定方法

微生物(指好氧或兼性厌氧微生物，下同)培养：挑取0.5 g塘泥37 ℃溶解于0.9 % NaCl溶液中制成2.5·10-4g/mL塘泥混合液，吸取0.5 mL混合液涂布于LB培养基上[16]，设置3个重复，37 ℃无光培养24 h后统计菌落数n[17]。

微生物总DNA提取[18]：称取1 g土样与提取液于5 mL离心管中涡旋混合，之后迅速至于-81 ℃冷冻30 min，取出并65 ℃水浴融化，如此反复进行裂解3～5次；加入8 μl蛋白酶K(25 mg/mL)，于37 ℃摇床上震荡30 min(225 r/min)；加入1.5 mLSDS(200 g/L)，65 ℃水浴2 h，每15 min左右颠倒混匀；微微离心(20 g，20 s)后将液相转入新的5 mL离心管中继续室温离心10 min(6000 g)；土样继续加入提取液和0.5 mL SDS，涡旋混合后65 ℃水浴10 min，接着室温离心20 min(6000 g)，上清液与前次上清液合并；上清液加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)进行抽提，之后室温离心5 min(6000 g)；将液相转入1.5 mL离心管中，加入0.6体积异丙醇后室温沉积1 h，之后再进行室温离心10 min(10 000 g)收集核酸；用冷的700 mL/L乙醇洗涤沉淀，吹干，溶于50 μl灭菌超纯水中， -20 ℃保存。

PCR[16]：于冰上向PCR管中加入40.5 μl去离子水、5 μl 10×PCR反应缓冲液、1 μl模板、1 μl核酸、2 μl上下游引物(V3V4引物：341F 5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′,806R 5′-GGACNNGGGTATCTA AT-3′)、0.5 μlTaq-DNA聚合酶后涡旋混合；设置94 ℃预变性2 min，97 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，30轮循环，最后1循环结束后72 ℃延伸10 min。

检测条带：取10 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若无条带则调节PCR反应条件或再次提取微生物总DNA，直至检测出现条带。

高通量测序：样品委托深圳市恒创基因科技有限公司代为进行高通量测序(Illumina MiSeq测序平台)工作。

1.4 数据处理与分析

微生物密度公式C=8n×103cfu/g使用SPSS19.0软件对获得数据进行统计分析，采用Duncan多重比较法检验组间差异，设置重复的处理以均值(E±SD)为结果，在Excel2016软件中制作图表；塘泥微生物群落特征与环境因子之间的关系使用CANOCO4.5软件进行分析并作图。

2 结果与分析

2.1 塘泥环境因子

由表1可知，塘泥温度春季最低，夏季最高，总体在19.3～33.4 ℃；塘泥试验初期由碱性快速转变为中性，之后春、夏、秋季均稳定在7.09～7.20；塘泥O.R.P持续升高，但始终保持强还原性；塘泥有机质、TN、TP、TK等营养成分含量均呈升高趋势。综合比较，夏、秋季塘泥环境因子数值相近，与春季差异较大。

2.2 塘泥微生物群落特征季节变化

2.2.1 塘泥微生物群落多样性季节变化 由表2可知，春季塘泥微生物密度显著高于夏季和秋季(P<0.05)，分别为2.954×106、1.587×106和1.504×106cfu/g；春、夏、秋季3次取样过程中，塘泥Shannon、Chao和Observed species等群落多样性指数均持续升高，而塘泥Simpson Index和Pielou Index多样性指数夏季均为最低，但均接近于1。

2.2.2 塘泥中微生物门类季节变化 经取样测序分析，春、夏、秋季塘泥中分别包括33、42、41门微生物，共归属44门，其平均丰度前15的门类占总微生物比例超过94.0 %。由图1可知，在春、夏、秋季塘泥中变形菌门和拟杆菌门均为优势门类；酸杆菌门、梭菌、厚壁菌门和疣微菌门均为大量(大于1 %)微生物门类；绿弯菌门、Elusimicrobia、螺旋体、Latescibacteria、芽单胞菌门和纤维杆菌门等微生物门类在各季节丰度变化幅度较大；Saccharibacteria、硝化螺旋菌门和放线菌等3个微生物门类在各季节丰度均低于1.0 %。不同季节塘泥中优势和大量微生物门类相似。

2.2.3 塘泥中丰富前10微生物属季节变化 对春、夏、秋3个样本中塘泥微生物进行属级统计分析，并将不同季度占比前10的属绘制成图2。统计分析发现，3个样本中共检测到2783种微生物(OUTs)，其中大多数为尚未定义或研究的类群，可分类到属的共有323属，可分类到种的共有76种。由图2可知，不同季度占比前10的属共包括16个属；未培养的腐螺旋菌科、噬氢菌属、Draconibacteriaceae-uncultured和未培养的芽单胞菌科在春、夏、秋季占比均在前10之列；2个季节中占比均在前10之列的属数量：春季和夏季有5个、春季和秋季有6个、夏季和秋季有8个。不同季节塘泥中占比前10的微生物属差异明显，相同的属在不同季节占比也十分不同。

表1 塘泥环境因子季节变化

表2 塘泥微生物群落多样性季节变化

图1 塘泥中微生物门类季节变化(%)Fig.1 Accounted for the phylum taxa abundance of the pond mud in different season at phylum level

2.2.4 塘泥中功能微生物季节变化 在池塘养殖过程中，许多微生物对渔业生产有其独特的功能和作用，于生产有利的可归为益生菌，而不利的则可归为有害菌。由表3可知，春、夏、秋季塘泥中出现益生菌包括硝化菌和放线菌，有害菌包括黄杆菌、肠杆菌、气单胞菌和假单胞菌；硝化菌和放线菌在春、夏、秋季塘泥中均有一定丰度，夏季塘泥中两种益生菌占比均为最高，春季均最低；春季塘泥中4种有害菌占比均大于0.01 %，夏季塘泥中前3种有害菌占比大于0.01 %，秋季塘泥中仅有黄杆菌和气单胞菌占比大于0.01 %。

对主要微生物属编号，以便下文RDA分析作图Numbered the main genus for RDA analysis and plotting图2 塘泥中主要微生物属比例季节变化(%)Fig.2 Accounted for the genus taxa abundance of the pond mud in different season at genus level

2.3 塘泥微生物群落与环境因子的关系

在复杂情况下，微生物种群与多个环境因子之间的关系常使用Canoco软件进行多元统计分析，该软件可以对环境因子和群落信息进行综合分析并分别指出它们间的相互关系[19]。

2.3.1 塘泥微生物群落多样性与环境因子的关系 由图1可知(Lengths of gradient<3)，微生物密度与塘泥环境因子均呈负相关性，O.R.P、SOM、TN和AP与微生物群落多样性呈较强的相关性，其它环境因子则较弱。由Canoco分析数据表明，仅SOM(-0.90)、TP(-0.87)和AP(-0.94)与第一排序轴相关性系数绝对值大于0.85，即在春、夏、秋季中塘泥SOM、TP和AP是影响微生物群落多样性的主要环境因子，且与微生物密度呈显著负相关性(P<0.05)。

2.3.2 塘泥中微生物与环境因子的关系 由图2可知(Lengths of gradient<3)，春、夏、秋季分别位于3个象限且距离较远，表明塘泥微生物群落季节差异十分明显，而夏和秋季距离相对最近即塘泥微生物群落结构相似性相对较高。从Canoco分析数据发现，仅T(0.87)、pH(0.89)和AP(0.86)与第一排序轴相关性系数绝对值大于0.85，即在春、夏、秋季中塘泥T、pH和AP是影响群落中丰度较高微生物分布的主要环境因子，而不同微生物与主要环境因子关系各有不同，总体上显著负相关的微生物种类较多(Fluviicola、噬氢菌属、Fluviicoccus、Lacibacter和env.OPS17，P<0.05)，显著正相关的微生物种类较少(Hados.Sed.Eubac.3和硝化螺菌属，P<0.05)。在春、夏、秋季中益生菌均与环境因子呈正相关性，有害菌中除肠杆菌属与环境因子呈正相关性外，其它3种均与环境因子呈负相关性，且与主要环境因子显著负相关(P<0.05)。益生菌与夏季距离最短，与春季距离最长，表明夏季益生菌丰度较高，春季最低；总体上有害菌与春季距离最小，即春季有害菌丰度最高。

表3 塘泥中功能微生物比例季节变化

图3 塘泥微生物群落多样性与环境因子RDA分析Fig.3 Redundancy analysis (RDA) of seasonal variations of the microbial community diversity index with environmental factors

3 讨论与结论

塘泥中营养物质主要来自沉积和化能自养生物合成，而在养殖池塘中投饲残饵、水产品排泄物和生物体沉积更为显著，这是导致池塘塘泥营养物质不断增加的主要原因[20-21]。试验中，春夏季期间营养物质剧增，而夏秋季变化不显著，这可能是因为春夏期间气温低且变化幅度大，鱼摄食不积极且塘泥微生物和相关分解酶活性相对较低，导致残饵大量沉积，而夏秋期间则气温较高，鱼摄食积极且微生物和相关酶活性较高，使得沉积物变化不显著。水体有机质分解会大量消耗塘泥间隙和底层水的溶解氧，致使塘泥和底层水转变为厌氧的还原环境，在这种条件下有机质分解往往产生有机酸和无机酸，导致塘泥酸化，pH降低[13]。故而在养殖过程中，养殖户常向池塘投放生石灰以调节酸碱度。张金宗等[22]在研究广东增城的池塘发现塘泥厚度以年均10～15 cm速度升高，这部分新增的淤泥含大量养殖残饵、营养成分丰富，可在清塘过程中将此收集、晒(烘)干并加工成有机肥料[23]。

塘泥营养物质的变化受微生物及其分泌酶的影响，而微生物群落结构也受到营养物质在内的环境因子的作用，通常微生物生长对养分的需要求始终趋向于较高的C、N、P含量[24]。这与试验中Shannon、Chao、Observed species等多样性指数均随塘泥有机质含量增大而升高现象相符。进一步分析发现环境因子中SOM、TP和AP对塘泥微生物群落多样性综合影响达到显著，即在紫色土池塘中SOM、TP和AP是塘泥微生物群落多样性的主要环境影响因子。试验中培养的微生物密度逐季下降，即好氧或兼性微生物在塘泥中渐渐消亡，这表征出塘泥间隙和底层水环境中氧气越来越低。所以在养殖过程中需注意天气变化导致水层对流，避免底层水上升导致鱼缺氧或中毒。主要及功能微生物属与环境因子冗余分析发现，塘泥微生物群落差异表现为春季与夏、秋季间明显，而夏、秋季间趋小，环境因子差异表现类似差异，这充分说明环境因子是微生物群落的影响因素，不同环境下相同微生物种群的丰度可能不同。本试验表明温度、pH和AP是影响塘泥主要微生物类群和功能微生物的主要因素，但这并不意味该4种环境因子一定是影响所有微生物的主要因素，同时其它环境因子仍然可能是影响某些微生物的主要因素[25]。从图4可知，其它4种非主要环境因子与数种微生物属之间的相关性同样显著。

图4 塘泥微生物与环境因子的RDA分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) of pond mud microbial communities with environmental factors

研究[26-27]表明，硝化螺菌、亚硝化单胞菌和硝化螺旋菌等在底泥中仍可进行硝化作用，将氮素转化为易溶解和利用的NO3-N。试验中，硝化细菌与塘泥中TN含量变化趋势一致，可能是与含氮有机物含量升高引起硝化细菌大量繁殖并将其氧化分解有关，这有利于池塘底泥的修复和缓冲能力的增强。放线菌在渔业养殖系统中可以起到一定的抑制致病微生物滋生和改善水质的功能[28-29]。黄杆菌属包括多种鱼类致病细菌，其中柱状黄杆菌可使几乎所有淡水鱼类感染柱形病[30]，病鱼将呈现烂鳃、体表溃疡、组织坏死及鳍条腐烂等症状，致死率几乎达100 %，具有极高危害性。陈霞等[31]还指出柱状黄杆菌易致病温度温度为25～30 ℃，几乎完全覆盖试验过程中塘泥温度区间，这提示紫色土池塘养殖过程中应加强柱状黄杆菌潜在致病管理。阴沟肠杆菌和阪崎肠杆菌是肠杆菌属中常见的鱼类致病菌，研究指出[32-33]该 2 种微生物也是人畜的致病原，可导致多种严重疾病，故而需对其进行严格管理，避免感染人畜。气单胞菌属隶属于弧菌科，含多种可感染水产品的病原微生物，其中嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌等危害尤为显著，可单独或混合造成草鱼肠炎、鲢打印病、鲢白皮病、草鱼烂鳃、鲢出血感染及甲鱼败血症等疾病，在预防和治疗过程中应注意精确诊断，联合使用预防治疗药物[34]。铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌是假单胞菌属在环境中常见的致病微生物，常造成赤皮病和烂鳃病，而沈锦玉等[35]研究指出恶臭假单胞菌还可造成网箱养殖大黄鱼脾、肾脏出现大量白色结节而大面积死亡。以上对塘泥中功能微生物的分析表明，塘泥微生物既是塘泥生态修复功能菌库，也是养殖水产品病原库。试验中春季塘泥益生菌丰度最低且有害菌丰度最高，所以在利用紫色土建造池塘进行养殖时应做好春季疾病预防工作。