几种豆制酱油中代谢产物的非靶向成分解析

龚一耘，董 玲，罗 静，赵 驰，李 露，郭云建，李治华，朱永清*

(1. 四川省农业科学院, 四川 成都 610066; 2. 四川省农业科学院农产品加工研究所, 四川 成都 610066; 3. 郫都区农业农村和林业局, 四川 成都 611730)

【研究意义】酱油中的代谢产物是影响其品质的重要因素。对中日4种知名品牌酱油的成分结构进行解析，对酱油原料的选择(原材料品质育种)、代谢通路研究、发酵工艺改良以及促进我国自主品牌酱油的提档升级，进一步增强民族酱油产业的核心竞争力，满足广大民众对健康和美好“滋味”的追求都具有重要意义。同时，本研究采用非靶向代谢组学研究方法，以UPLC-ESI-QTOF-MS的先进技术来揭示酱油代谢产物，为进一步解析酱油中的未知代谢产物提供理论依据和方法参考，也为今后靶向精准测定酱油中的代谢产物奠定了基础。【前人研究进展】目前，对酱油的研究主要集中在发酵菌种微生物[1-2]、酿造制作工艺[3-5]、风味[6-8]、品质成分[9-10]以及潜在安全性[11]等方面。其中，对酱油代谢物质进行分析有利于阐释微生物菌群功能[12]，揭示风味形成机理和实现发酵过程控制[13]。例如，韩国学者对泡菜中葡萄糖、果糖、乳酸、乙酸、甘露醇和氨基酸等代谢产物的研究，对提升韩国泡菜的风味和口感起到了举足轻重的作用[14]。对于酱油中的代谢产物分析大多使用高效液相色谱，主要以紫外吸收波谱以及保留时间与标准品的比对来确定代谢产物，且灵敏度较低，分析时间长，无法对未知成分进行鉴定。【本研究切入点】对酱油中的代谢产物，目前还缺乏系统全面的分析，还存在大量未知物质有待鉴定。本研究以UPLC-ESI-QTOF-MS技术非靶向解析酱油中的代谢产物，并采用MS-DIAL和XCMS生物信息学软件对实验数据进行多元变量统计分析，揭示样品中存在显著差异的代谢产物。非靶向代谢组学是一门无偏向性地对所有小分子代谢物同时进行检测分析的代谢组学。相对于靶向代谢组学，非靶向代谢组学具有无偏向性、高通量和样本无需特殊处理且一次进样分析的优点。目前，GC-MS、LC-MS和NMR是国内外公认应用较广泛的代谢物分析技术。相比GC-MS，LC-MS技术更适用于难挥发性、热不稳定性物质的分析；MS较NMR检测动态范围更宽，灵敏度和分辨率更高。UPLC-QTOF-MS是一种既具有高通量分析检测技术又能够快速获取数据、处理数据的新型联用技术，具备数据信息丰富、高灵敏度、专属性强、效率高、检测模式多样、分析速度快等优点，尤其擅长于复杂化合物的分离及鉴定。它能精确提供化合物的质量数、同位素分布等信息，可实现痕量化合物的检测和定量分析。与HPLC-MS相比，分离度更高、灵敏度更高、分析速度更快、对复杂样品的处理要求更低。。XCMS是由世界著名质谱数据研究机构美国斯克里普斯研究院(Scripps Research Institute)中心开发，具有网络版和命令模式，其中网络版整合了METLIN数据库[15]。MS-DIAL分析软件 是日本理化研究所教授Masanori Arita教授团队开发的世界上第一个可以跨平台处理数据非依赖性采集模式(Data-independent acquisition, DIA)的开源软件，已被同行广泛采用和引用[16]。【拟解决的关键问题】明确4种中日知名品牌酱油中存在显著差异的成分物质，为解析酱油中的未知代谢产物及靶向精准测定酱油中的代谢产物提供理论依据和方法参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

每个实验样品的采集均重复3次。因本研究样品购买于超市，未经产品生产企业知晓，为避免相关知识产权纠纷，因此品牌名仅用字母标识。样品信息见表1。

1.2 仪器与试剂

超高效液相(1290 UPLC) Agilent公司；高分辨质谱(Triple TOF 6600) AB Sciex公司；高分辨质谱(QTOF 6550)Agilent公司；超声仪(PS-60AL) 深圳市雷德邦电子有限公司；色谱柱(ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm 2.1*100 mm) Waters公司；色谱纯甲醇、乙腈、乙酸铵和氨水 CNW Technologies公司；L-2-氯苯丙氨酸 上海恒柏生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备 300 μl酱油样本，与 300 μl提取液(甲醇乙腈水体积比=2∶2∶1)涡旋混匀30 s；冰水浴超声10 min；在4 ℃条件下，13 000 rpm/min离心15 min；取500 μl上清于1.5 mL EP 管中真空浓缩干燥；向干燥后的代谢物加入1000 μl 提取液(乙腈水体积比=1∶1)复溶；再次涡旋30 s，冰水浴超声10 min；将样本在4 ℃条件下，12 000 r/min离心15 min；取60 μl上清置于2 mL进样瓶，用作色谱分析。每个样本各取10 μl混合成QC(Quality Control)样本。

1.3.2 超高效液相色谱条件 样品在安捷伦1290超高效液相仪控制下，所使用的色谱柱为UPLC BEH Amide 色谱柱(1.7 μm*2.1*100 mm)。进样体积为2 μl。QC样本上机检测，重复3次，用QC1、QC2和QC3表示。流动相A为25 mM乙酸铵和25 mM氨水混合溶液，流动相B为乙腈，流速为500 μl/min，洗脱程序：0～0.5 min，95 % B；0.5～7 min，95 %～65 % B；7～8 min，65 %～40 % B；8～9 min，40 % B；9～9.1 min，40 %～95 %B；9.1～12 min，95 % B。

表1 实验材料

1.3.3 飞行时间质谱条件 使用数据依赖型采集(DDA)模式进行， 一级质谱正模式(Positive)数据采集条件：在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子，并采集其对应的质谱数据。质谱参数如下：干燥气温度250 ℃；干燥气体积流量：16 L/min；喷雾器：20 psig；鞘气温度：400 ℃；鞘气流速：12 L/min ；毛细管电压：3000 V；节点电压：0 V；碎裂电压：175 V；一级质谱扫描范围：50～1200；质谱图的采集速率：4 HZ；循环时间：250 ms。二级质谱数据采集条件：将上述一级质谱筛选出的分子离子，进一步碎化并采集其质谱数据。数据采集时按质谱范围进行分段：50～300，290～600，590～900，890～1200，扩大二级谱图的采集率。每个方法每段采集4个重复。每50 ms获得15张二级谱图。参数如下：雾化气压：40 psi(1 psi = 6. 895 kPa)；加热气：80 psi；帘气：25 psi；源温度： 650 ℃；源喷射电压：5000 V；锥孔电压：60 V；碰撞能量：35±15。

1.3.4 数据处理 基于XCMS软件的数据处理：使用Agilent Qualitative Analysis B.06.00商业软件将一级质谱原始数据转成mzData格式。再使用XCMS做保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作，XCMS(version 3.2.0)在R语言(version 3.5.1)中执行，参数为XCMS 默认参数[15]。

基于MS-DIAL2.0软件的数据处理：使用AbfConverter(https://www.reifycs.com/ AbfConverter/index.html)开源软件将质谱原始数据转换成ABF格式，再使用MS-DIAL2.0软件做保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐及物质鉴定[16]。

采用软件SIMCA14.1对XCMS数据和MS-DIAL2.0数据进行统计分析，找出不同分组之间的显著性差异，并进一步依据显著性差异物质进行二级质谱鉴定，以最终确定物质。

2 结果与分析

2.1 实验整体色谱图结果

代谢物质主要出峰时间集中在1～9 min(图1)，不同实验样品之间峰图存在差异，表明中日酱油代谢成分结构存在较大差异。

2.2 XCMS软件处理和分析结果

采用XCMS默认参数处理共得到1319个特征峰(Features), 采用软件SIMCA14.1 (Umetrics, Sweden)对上述特征峰进行统计分析，主成分分析(PCA)将所有的代谢产物变量降维为PC1和PC2 2个主成分，PC1和PC2可解释度为79.3 %(51 %+28.3 %)。图2中绿色代表JS1(S1～S3)和JS2(S4～S6)，蓝色代表CS1(S7～S9)和CS2(S10～S12)。其中，日产酱油JS1和JS2 2个品牌差异不大，而国产酱油2个品牌CS1和CS2存在较大差异。

采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA，图3)，进一步解释和验证PCA结果。评价OPLS-DA 模型拟合效果使用的3个指标R2X、R2Y和Q2，可解释度越接近1，表示OPLS-DA 模型建立的越好。

图1 全样品UPLC-QTOF-MS检测正离子模式总离子流(不同颜色代表不同样本)Fig.1 Total ion flow of positive ion modes detected by UHPLC-QTOF-MS in all samples (different colors represent different samples)

图2 4种中日酱油主成分分析Fig.2 Principal component analysis of Chinese and Japanese soy sauce

其中，R2X表示该模型能够解释自变量的百分比，在本研究中即指代谢产物；R2Y表示能够解释因变量的百分比，在本研究中即能否辨别中日酱油两种分类；Q2表示OPLS-DA模型的预测能力。OPLS-DA两个主成分OPLS1和OPLS2，即R2X可解释度为0.793(0.463+0.33)、R2Y为0.998、Q2为0.995，表明所构建的OPLS-DA模型有置信度较高的预测能力。证实了4种品牌的中日酱油的代谢产物存在显著差异。

OPLS-DA的S-plot作图进一步分析了产生上述差异的主要原因。图4表明，日产2种酱油JS1(S1-3)、JS2(S4-6)和国产2种酱油CS1(S7-9)、CS2(S10-12)中的某一代谢产物175.1/497(mz/RT，暂以此数据代表该物质)存在显著差异。该物质的质荷比mz为175.1，保留时间RT为497 s。

绿色代表JS1(S1～S3)和JS2(S4～S6)；蓝色代表CS1(S7～S9)；CS2(S10～S12)图3 4种中日酱油OPLS-DA分析Fig.3 OPLS-DA analysis of four different Chinese and Japanese soy sauces

图4 中日4种酱油S-plot分析(a)Fig.4 S-plot analysis of four different Chinese and Japanese soy sauces(a)

S-plot统计分析还表明，日产2种酱油中代谢物质175.1/497(mz/RT)均显著高于国产2种酱油(表2)。

表2 4种中日酱油种精氨酸和哈尔满相对含量比较

物质175.1/497(mz/RT)在主成分(PC1)载荷图中的峰值最大(图5)，代表它对主成分(PC1)的贡献值越大。

图5 主成分分析载荷图Fig.5 Loading plot for PC1

在二级质谱图(图6～7)中找到时间497 s(8.23 min)的二级质谱图，将此二级质谱数据与MS-DIAL的数据库比对。鉴定得到物质为：精氨酸(Arginine)，即：采用精氨酸作为标记(Marker)能够准确辨别上述4种中日酱油(辨别度99.8 %)，且2种日产酱油中精氨酸的含量显著高于2种国产酱油。

图6 二级质谱图(a)Fig.6 Secondary mass spectrometry (a)

图7 二级质谱对比图(a)Fig.7 Second-order Mass Spectrometric Contrast Diagram(a)

图8 四种中日酱油S-plot分析(b)Fig.8 S-plot analysis of four different Chinese and Japanese soy sauces(b)

2.3 MS-DIAL软件处理和分析结果

由于有文献报道不同质谱处理软件对质谱Feature即峰提取(peak picking)存在差异，不同处理软件会导致差异显著的结果[17]。因此，在采用XCMS处理和分析数据的同时，另外采用了MS-DIAL软件，以提升实验结果的精准性和全面性。采用MS-DIAL默认参数处理共得到7054个特征峰(Features), 采用软件SIMCA14.1 (Umetrics, Sweden)对上述特征峰进行统计分析。

图9 二级质谱图(b)Fig.9 Secondary mass spectrometry (b)

由图8～10可知，相比XCMS的结果，MS-DIAL多鉴定出了一个183.1/50(mz/RT), 其相应的二级质谱如下，鉴定出物质为生物碱哈尔满(Harmane)。

3 讨 论

日产2种酱油中精氨酸和哈尔满显著高于国产2种酱油，但精氨酸、哈尔满与酱油品质、功能的关联性还有待进一步研究和验证，目前也没有相关文献报道。因此，尚不能据此判定中日4种酱油的品质优劣，但可以为今后国产酱油的多元化产品开发提供参考。

目前，对成分物质作靶向定量检测采用的主要方法是液相色谱法、气相色谱法以及紫外分光光度法等。由于酱油成分物质庞杂，采用这些方法难以开展非靶向结构解析，且耗时长、灵敏性低、重复性差。因此，在靶向定量检测前先确定检测靶标物质是有必要的。

采用色谱-质谱联用技术等先进方法，通过非靶向成分结构解析，“定位”到靶标检测物质，有针对地对酱油成分物质定量检测，是提高检测效率和结果准确度的有效途径。需要注意的是，由于质谱数据库尚不完善，还存在大量未知物质有待鉴定。

有研究表明，通过酵母菌等微生物作用将原材料大豆中的蛋白质降解转化为酱油中的游离态氨基酸等代谢产物[18]；而游离氨基酸是构成酱油鲜味整体特性的主要来源，直接影响酱油品质[19-20]。因此，提高大豆的蛋白质含量和提升大豆蛋白质的代谢转化率，是今后开展多领域联合研究提高酱油品质的2种途径。

目前，美国、日本等发达国家不断加强对豆蛋白的开发，我国大豆品质育种也已选育出冀豆15、豫豆22号、齐黄27、郑9525、中黄22等一批以高蛋白(蛋白质含量在45 %以上)为育种目标的功能性材料和品种[21]。这为提升国产酱油的品质奠定了基础；也为我国大豆品质育种以产业需求和发展为核心，为产业提出前瞻性的育种目标，以育种引导大豆后续加工提供了思路。

4 结 论

本研究基于超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-ESI-QTOF-MS)和氢谱核磁共振(H-NMR)两种国际公认的先进技术，非靶向解析了中日4种知名品牌酱油(JS1、JS2、CS1、CS2)的成分结构，确定了其中存在显著差异的精氨酸、哈尔满和糖类物质，探索建立了一种解析酱油未知成分的方法。获得的如下研究结果为解析酱油中的未知代谢产物提供了方法参考，为进一步通过标准品绝对定量检测精氨酸、哈尔满等靶标代谢产物提供了理论依据，也为今后结合酱油原料的选择(大豆高蛋白品质育种)、代谢通路研究、发酵工艺改良开展多领域联合研究奠定了基础。这对国产酱油的提档升级具有重要意义。

(1)基于UPLC-ESI-QTOF-MS的一级质谱数据进行主成分降维多元分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，发现JS1、JS2和CS1、CS2中质荷比/保留时间分别为175.1/497(mz/RT)、183.1/50(mz/RT)的2种物质存在显著差异。再将这2种物质的二级质谱数据与MS-DIAL数据库比对，鉴定得到这2种物质分别为精氨酸和生物碱哈尔满。

(2)基于OPLS-DA的S-plot分析表明，日产2种酱油中代谢产物精氨酸、生物碱哈尔满的相对含量显著高于国产2种酱油。其中，日产酱油JS1、JS2中的精氨酸质谱丰度分别为3.42×107、3.32×107，显著高于国产酱油CS1(0.98×107)、CS2(1.72×107)；日产酱油JS1中的生物碱哈尔满质谱丰度为2.02×107，高于日产酱油JS2(1.58×107)，显著高于国产酱油CS1(1.16×107)和CS2(0.84×107)。

(3)基于OPLS-DA的数据分析模型显示精氨酸能准确将4种酱油(JS1、JS2、CS1、CS2)区分为日产和国产两类，准确度达99.8 %。表明可以将精氨酸用作辨别日产酱油和国产酱油差异的候选标记(Marker)。

(4)相比开源软件XCMS鉴定的QTOF-MS数据结果，MS-DIAL软件多鉴定出了质荷比/保留时间为183.1/50(mz/RT)的物质，即：生物碱哈尔满(Harmane)。