转录调控因子Lmo2672对LM环境适应性和应激的调控作用

李 杰，张星星，孟庆玲，乔 军*，李 妍，王晓婷，李 静，才学鹏

(1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆 石河子 832000；3.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)

【研究意义】单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)是一种重要的食源性病原菌之一，广泛分布于自然界，能在外界环境中长期存活[1]。人类通过食用被感染的食物经消化道感染机体，引起感染者发生败血症、脑膜炎、胃肠炎、流产等严重疾病；免疫能力低下者感染后死亡率较高[2-3]。LM能在0.4 ～ 45 ℃、pH值2.5、渗透压高、20 % NaCl和0.025 %过氧化氢等极端环境中生长和生存[1,4-5]，是动物源性食品生产加工过程中的常见污染菌，对食品安全构成了严重的威胁。【前人研究进展】为了适应不同环境，LM转录调控因子可通过调控相关基因的表达从而改变其环境适应能力[8-9]。目前，已在LM中鉴定出多种环境调控因子，其中prfA和sigB在环境应激反应中扮演重要角色，它们通过调节抗性基因的转录使LM适应各种不利环境[6-9]。此外，HrcA和CtsR也参与应激反应基因的调控[10-12]；SOS作为修复受损DNA的一种机制，而RecA和LexA分别控制SOS反应的激活和抑制，也参与了对环境胁迫的适应性[16-17]，有研究发现，AraC家族是存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中的一种转录因子，对细菌一些基因的转录具有调控作用，参与细菌毒力的调控及抵抗不良应激环境[6,15]。该家族中的螺旋-旋转-螺旋(HTH) DNA结合结构域可与基因的启动子结合，激活基因转录从而发挥调控作用[16-17]。前期的生物信息学分析表明，lmo2672属于AraC家族成员，然而目前LMlmo2672具体的生物学功能尚不清楚。【本研究切入点】本研究利用构建的lmo2672基因缺失株，比较LM EGD-e与LM-Δlmo2672在不同应激环境中环境适应能力，通过qRT-PCR分析了应激调节因子(prfA、sigB、ctsR、hrcA、lexA、recA)和氧化应激相关基因(fri、kat、perR、sod)转录水平的变化，探讨了lmo2672对LM氧化环境中的调控作用。【拟解决的关键问题】为进一步揭示AraC家族转录调节因子Lmo2672在LM中的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

LM EGD-e菌株由德国伍兹堡大学W. Goebel惠赠；pKSV7由本实验室保存；pMD19-T载体、T4连接酶、限制性酶切酶KpnI和PstI购自TaKaRa公司，基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自TIANGEN生物有限公司，氯霉素、胆汁酸盐购自Sigma公司，氯化钠购自天津盛奥生物试剂公司，脑心浸出液(BHI)购自青岛海博生物科技有限公司。

1.2 引物

根据GenBank发表的LM标准株(LM EGD-e)基因组序列(登录号：AL591824.1)，应用Primer 5.0软件设计LM缺失株的构建、鉴定及qRT-PCR相关引物，其中R1和R4引物的5’端分别引入酶切位点KpnI和PstI (斜体下划线部分)，引物均由北京华大基因公司合成 (表1)。

表1 本研究中所用引物

续表1 Continued table 1

1.3 LM-Δlmo2672缺失株的构建与鉴定

采用基因组DNA提取试剂盒提取LM EGD-e菌株的基因组DNA，以DNA为模板，利用引物R1/R2、R3/R4分别扩增lmo2672基因的上、下游同源臂，将获得的PCR产物经1 %琼脂糖凝胶进行电泳，根据胶回收试剂盒的操作步骤进行回收，将上、下游臂的胶回收产物进行融合，获得缺失目的基因的融合片段。将其与温控质粒pKSV7进行16 ℃过夜连接，构建重组穿梭质粒pKSV7-Δlmo2672。将pKSV7-Δlmo2672电转至LM感受态细胞中，在氯霉素和42 ℃双重抗性下进行同源重组获得缺失株，对获得的LM-Δlmo2672缺失株用旁外侧引物R5/R6检测并测序进行鉴定。同时将LM-Δlmo2672缺失株在无氯霉素抗性，37 ℃继续培养20代并用R5/R6进行PCR检测其遗传稳定性。

1.4 lmo2672基因缺失对LM在不同应激环境中适应能力的影响

分别挑取LM EGD-e和LM-Δlmo2672单菌落过夜培养，调整菌液OD600约为0.4，分别接种于新鲜BHI培养基放置于不同温度(37、42 ℃)，或者分别在37 ℃接种于含5 % NaCl、0.3 %胆酸盐、5 mM H2O2、1 % Triton X-100的BHI培养基中培养。每株菌设置3个平行，每2 h测定其OD600 nm以代表菌株生长情况，绘制生长曲线比较LM EGD-e和LM-Δlmo2672生长曲线。

1.5 RNA的提取及cDNA的合成

将待测菌株在37 ℃，180 r/min过夜振荡培养，离心收集菌体，用含5 mM H2O2BHI调整菌液OD600至0.6，并放置37 ℃暴露于H2O2环境中30 min；离心收集菌体，用液氮研磨至粉状；根据Trizol法的操作分别提取LM EGD-e和LM-Δlmo2672细菌总RNA；使用Nanodrop 2000测量RNA浓度，并通过260/280和230/260 nm的比值以评估RNA是否被蛋白质和有机物污染。同时利用两步法反转录试剂盒说明书将RNA进行逆转录，得到终体积为20 μl的cDNA；并用Nanodrop 2000分光光度计测定cDNA浓度。

1.6 相关基因转录水平的qRT-PCR分析

以统一浓度的cDNA为模板，以管家基因rpoB作为内参，在LightCycler 480仪器上进行qRT-PCR，反应采用SYBR Green Ⅰ Master mix和1.0 μM浓度的引物进行。测定6个环境应激调控相关基因(prfA、sigB、ctsR、hrcA、lexA、recA)和4个氧化应激相关基因(perR、kat、sod、fri)的转录水平，结果根据2-ΔΔCT的方法计算各个基因的相对转录水平。本试验进行3次独立重复，结果以“平均值±标准误”表示。

1.7 数据统计分析

所有试验均重复3次，采用GraphPad Prism 5.0进行组间差异显著性分析，数据采用平均值±标准误。P<0.05被认为差异显著，P<0.01被认为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 LM-Δlmo2672的构建、鉴定及遗传稳定性分析

利用R5/R6引物筛选扩增出1502 bp条带的重组菌株(图1)；同时进行测序，测序结果进一步证明成功构建LM-Δlmo2672缺失株。在37 ℃、无氯霉素抗性的培养基中继续传20代，R5/R6引物检测均可扩增出1502 bp单一片段(图2)，表明LM-Δlmo2672具有良好的遗传稳定性。

2.2 lmo2672基因缺失对LM环境适应能力的影响

在37和42 ℃条件下，在37 ℃更适应LM菌生长，且2株菌的生长趋势相同，在细菌对数生长期中， LM-Δlmo2672的生长显著慢于LM EGD-e(P< 0.05，图3-A、图3-B)；在含5 % NaCl培养基中，0～6 h LM EGD-e和LM-Δlmo2672几乎不生长，在6 h之后LM-Δlmo2672生长速度显著低于LM EGD-e(P<0.05，图3-C)。在1 % Triton X-100 BHI中, 与LM EGD-e相比，LM-Δlmo2672在6～12 h内生长差异显著(P<0.05，图3-D)；在含0.3 %的胆酸盐培养基中培养8 h以后，2株菌生长情况差异显著(P<0.01，图3-E)；在含5 mM H2O2BHI培养基中LM-Δlmo2672不生长，极显著低于亲本株LM EGD-e(P<0.01，图3-F)，表明lmo2672缺失降低了LM的环境适应能力。

M：DNA Marker DL-2000；1：LM EGD-e；2～3：LM-Δlmo2672重组菌；4：阴性对照;5.LM EGD-e图1 LM-Δlmo2672重组菌的鉴定Fig.1 Identification of recombinant LM-Δlmo2672

2.3 环境应激调控基因及氧化应激相关基因转录水平的测定

在H2O2环境中暴露30 min后进行转录水平分析，结果发现，与LM EGD-e相比，LM-Δlmo2672中recA和fri基因的转录水平显著升高(P<0.05)，表明在氧化环境中lmo2672缺失能诱导recA和fri基因的转录水平；除recA和fri基因外，其余基因的表达量均出现不同程度的降低，其中prfA，lexA，fri，perR，kat，sod差异显著(P<0.05，图4)，表明lmo2672对LM环境应激和氧化应激相关基因的转录水平有影响。

M：DNA Marker DL-2000；1～3：LM-Δlmo2672重组菌；4：阴性对照；5：LM EGD-e图2 LM-Δlmo2672重组菌遗传稳定性的检测Fig.2 Analysis of genetic stability of LM-Δlmo2672

3 讨 论

LM具有极强的环境适应能力，能够在食品加工、贮藏、运输等应激环境条件生存[18-19]。为了适应不同的应激环境，LM依靠众多的调控因子进行转录调控。在大肠杆菌中研究发现，AraC家族蛋白在细菌应激反应中发挥了调控作用。AraC家族转录调控因子Rob通过上调micF使大肠杆菌对胆汁酸产生耐受[20-21]；Pletzer等人发现AraC家族转录调控因子OpiA过表达时对大肠杆菌在pH和高渗透压环境的耐受性显著增加[17]。然而，目前LMAraC家族成员Lmo2672的生物学作用至今尚不清楚。本研究利用同源重组技术构建LM-Δlmo2672缺失株，测定在不同应激环境中LM EGD-e和LM-Δlmo2672的生长情况。结果发现LM-Δlmo2672在37 ℃、42 ℃、5 % NaCl、0.3 %胆酸盐、5 mM H2O2及1 % Triton X-100的培养基中生长显著低于LM EGD-e，提示AraC家族Lmo2672在LM环境适应和应激过程中发挥了调控作用。

A～F：分别为42 ℃，37 ℃，5% NaCl，1 % TrionX-100，0.3 %胆酸盐，5 mM H2O2环境中的生长情况图3 不同应激环境对LM EGD-e和LM-Δlmo2672生长曲线的影响Fig.3 Growth curves of LM EGD-e and the LM-Δlmo2672 deletion mutant strains at different environmental stresses

图4 氧化应激环境下LM EGD-e和LM-Δlmo2672压力调控相关基因及氧化应激相关基因转录水平分析Fig.4 Relative transcriptional levels of the genes related to stress regulator and oxidative stress response in the LM EGD-e and LM-Δlmo2672 under the oxidative stress

在外界环境中，LM常暴露于氧化应激中，为了防止氧化应激引起的损伤，细菌自身的防御系统可通过启动相关的抗氧化机制来抵御ROS[22-23]。清除活性氧组分的超氧化物歧化酶(sod)将高活性的超氧化物转化为过氧化氢，过氧化氢又被过氧化氢酶(kat)转化为水和氧[24]；fri编码类铁蛋白Dps，据报道Dps在保护细胞抵御ROS时有双重作用，它可以直接与DNA结合调控应激相关基因的表达，以保护细菌免受H2O2的伤害[25]。研究表明，在不同的环境应激(例如热应激、冷应激、胆酸盐应激)中均可诱导fri基因的表达[26-28]。本研究发现，在氧化应激作用下，fri基因的转录水平发生明显改变，表明该基因参与了抵御氧胁迫的作用。有研究表明，外源性ROS造成的DNA损伤会诱导recA基因的表达启动SOS反应机制以适应氧胁迫环境[26-28]。本研究中发现，lmo2672基因缺失后，recA基因转录水平显著增强，推测可能是通过recA基因的高表达来启动SOS反应，从而维持其生存，提示lmo2672可通过调控recA基因的表达以抵抗环境应激。

4 结 论

总之，本研究通过构建LM AraC家族lmo2672基因缺失株，证实了LM-Δlmo2672缺失株通过调控环境应激相关基因的表达，显著降低抵抗环境应激的能力，尤其在氧化应激环境中，LM-Δlmo2672缺失株fri及recA基因被诱导高表达，表明lmo2672基因在适应氧化应激环境中发挥了重要的调控作用，为进一步探究LMlmo2672调控应激环境的分子机制奠定基础。