十字花科根肿病菌染色及药剂致死效果测定研究

施竹凤，裴卫华，王 会，张 庆，杨佩文，吴贵宏，李向东，彭荣珍，毕云青，杨明英*

(1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205；2.丘北县温浏乡农业综合服务中心，云南 丘北 663208；3.瑞丽海关综合技术中心，云南 瑞丽 678600)

【研究意义】十字花科蔬菜根肿病是由根肿菌属(Plasmodiophora)芸薹根肿菌(P.brassicaeWoron)侵染引起的土传病害[1]，俗称“根癌”。该病寄主范围很广，可危害大白菜、小白菜、甘蓝、萝卜等100多种栽培的和野生的十字花科植物[2]。该病在国内外各蔬菜产区均有分布[3-4]，随着农业种植结构的调整，十字花科蔬菜种植面积不断扩大，根肿病的发生危害也有加重趋势。根肿病菌为专性寄生菌，作物的苗期与成株期均可感病。根肿病菌通过侵染植物根系，使根部膨大，形成大小不一、形态各异的根瘤[5]，影响植株正常的生理生化功能，影响植株对水分及养分的吸收，从而引起植株地上部分发育不良，严重时导致整个植株枯萎死亡[6]，造成严重经济损失。根肿病菌是一种低等微生物，在土壤中以休眠孢子的形式长期存活[7]，因此植株一旦被该菌侵染，会增加土壤中新的菌含量，且由于农事操作不当，会导致感病田块中根肿病菌在全田扩散，从而该病发生不断加重。感染了根肿病菌后，一般用土壤塘施进行常规处理，但该方法无法彻底消灭根肿病菌，只能减少菌量，且根肿病菌一旦发生，土壤就难以清除干净，除非与其它科作物多年轮作，或者采用土壤消毒剂全田消毒处理。【前人研究进展】药剂防控是根肿病持续防控中的关键控病技术之一[8]，但大多数杀菌剂对根肿病的防控效果如何，必须进行田间试验。由于田间病田土壤中根肿病菌含量不均匀，病害发生受多种因素影响，试验结果往往不稳定；加之田间试验需投入较大人力物力财力，试验成本较高。加上根肿病菌尚未获得离体培养，病原菌以休眠孢子存活于土壤或植物组织，且病原菌体积小、难分离检测，从而给该病害的早期诊断带来很大挑战[9]。MacFarlane最早进行了根肿病菌休眠孢子的分离[10]，其它人采用的分离方法都是在此基础上优化改进的。Kenji Takahashi利用萤光染色技术对土壤中的休眠孢子进行检测与定量分析[11]；Arie则用萤光抗体技术对分离自土壤或植物根肿组织的休眠孢子进行检测[12]；Lange，Wakeham和White成功地对分离自土壤及根肿组织中的根肿病菌进行了血清学及扫描电镜检测[13-14]。以上这几种方法比较费时，且需要一定的实验技能和专用设备，因而应用上受到一定限制。作者团队通过多年试验研究及应用，针对十字花科蔬菜根肿病的防控，坚持在选用抗病品种条件下，以农业措施、生物调控为主，化学防控为辅的综合防控技术。以减少田间土壤菌源，改变根肿病菌适生环境，保护蔬菜生长前期的根系不受根肿病菌侵染等相应措施，即轮作、无菌土育苗移栽、土壤酸碱度或微生态调控、关键化学防控为主线的模式，减轻病害发生危害，达到控病增产目的。【本研究切入点】本研究拟对采集的十字花科蔬菜根肿病菌，通过孢子悬浮液进行药剂抑制效果测定，可快速及低成本大量筛选不同药剂致死效果。【拟解决的关键问题】通过孢子染色比较试验，筛选出检测孢子活性的染色剂及染色方法，测定不同杀菌剂控制根肿病菌的效果，为大田试验或示范提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

十字花科蔬菜根肿病菌来自嵩明县蔬菜基地的白菜根肿病病根。实验所用主要试剂：4 %台盼蓝母液、碘化丙啶(PI)、Hoechest33342 染液。供试药剂：搜集市场上杀菌剂19种，进行室内抑制效果试验，药剂种类及厂家详见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 根肿病菌孢子悬浮液的制备 将病样组织洗净，取10 g切碎，加入到50 mL灭菌水中，进行研磨；研磨后用4层纱布过滤，滤液移至50 mL离心管3100 r/min离心15 min，然后弃上清液；沉淀重溶于50 mL灭菌水3100 r/min离心10 min，此步骤重复2～3次，然后弃上清液；沉淀中加入50 %蔗糖溶液5 mL，混匀后3100 r/min离心10 min；取上清液到干净离心管内，加入30 mL灭菌水，3100 r/min离心10 min后弃上清液；沉淀重溶于30 mL灭菌水，3100 r/min离心10 min，此步骤重复2次；沉淀重溶于5 mL灭菌水[2]，最后将其浓度调节到1.0×108个孢子/mL，放置阴暗处备用。

1.2.2 试验处理 将19种不同种类药剂，采用说明书用量的最低剂量，计算出10 mL用药量，然后分别加入上述备好的孢子悬浮液中，摇匀，放置室温(13～24 ℃)条件下，每个药剂处理3次重复。设置2组对照：加无菌水的孢子悬浮液、在90 ℃水浴煮沸5 h的孢子悬浮液。定期震荡混匀。

1.2.3 观察时间及方法 将1.2.2的孢子悬浮液，在分别处理7、10、14 d后取10 μl溶液，加入500 μl无菌水，采用3000 r/min离心10 min，再加100 μl无菌水或100 μl(0.05 %硫代硫酸钠+10 %吐温80)进行重悬，镜检鉴定根肿病菌孢子活力，并统计死孢子与活孢子数。

1.3 根肿病菌孢子染色

1.3.1 染色液的配制 碘化丙啶(PI)：用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)将碘化丙啶配制成终浓度为100 μg/mL的PI储存液，4 ℃避光保存。Hoechest33342 染液：用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)将Hochest33342配制成终浓度为100 μg/mL的Hoechest33342储存液，4 ℃避光保存[1]。4 %台盼蓝母液：称取4 g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100 mL，用滤纸过滤，4 ℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4 %。

表1 不同药剂种类及用量

1.3.2 不同染色方法 PI单染：取新鲜的根肿病菌孢子悬浮液和水浴处理致死的孢子沉淀，用 PI 溶液重悬，4 ℃避光处理15 min，后用移液枪取10 μl反应液滴在载玻片上，制片，在显微镜下观察死、活孢子特征[1]。Hoechest33342单染：分别取新鲜的根肿病菌孢子悬浮液和水浴处理致死的孢子悬浮液、Hochest33342染液950、50 μl，37 ℃处理10 min，置于冷冻离心机1000 g/min 离心，去上清，用灭菌水1 mL洗涤，离心，去上清，在沉淀中加入950 μl 的灭菌水重悬，取10 μl制片，在显微镜下观察死、活孢子特征[1]。台盼蓝染色：孢子悬液与0.4 %台盼蓝溶液以9∶1体积比混合均匀，处理15 min，后取 10 μl制片，在荧光显微镜下观察死、活孢子特征[1]。

1.3.3 染色测定方法 将药剂处理过的根肿病菌孢子悬浮液稀释重悬后，采用台盼蓝染色测定根肿病菌休眠孢子活力，统计死孢子与活孢子数。所有孢子悬浮液染色处理前先检查新鲜休眠孢子自然死亡率。再用台盼蓝染料进行不同处理孢子悬浮液染色，着色后为蓝色即死亡，无色即存活，计算孢子死亡率。

1.4 数据统计与分析

每个样本均用血球计数板(25×16)观察，然后采用下面公式计算死亡率。

孢子死亡率(%)=[视野中着深蓝色的孢子数目/(视野中着深蓝色的孢子数目+视野中呈透亮状的孢子数目)]×100

2 结果与分析

2.1 不同染色剂染色效果筛选

2.1.1 根肿病菌孢子的分离富集及水浴处理 分离富集：利用50 %蔗糖溶液制备得高纯度的根肿病孢子悬浮液，在显微镜下观察，可见孢子大部分是单个存在的，且相互没有富集或堆积现象(图1-A)，便于后续实验的开展。孢子悬浮液热处理：将孢子悬浮液浓度调节为1.0×108个孢子/mL，90 ℃下水浴加热5 h，保证孢子全部死亡。在显微镜下观察，可见孢子呈团状集聚、重叠严重，且孢子颜色变深(图1-B)。

A：新鲜根肿病菌休眠孢子；B：90 ℃水浴处死根肿病菌孢子A: Dormant spores of Plasmodiophora brassicae; B: Execution of Plasmodiophora brassicae spores by water bath at 90 ℃图1 根肿病菌孢子Fig.1 Spores of Plasmodiophora brassicae

2.1.2 根肿病菌孢子自发荧光观察 通过镜检观察，新鲜孢子与90 ℃水浴处死孢子在不加任何荧光染料的情况下，有明显自发荧光现象。新鲜孢子自发荧光为蓝色(图2-A)，而90 ℃水浴处死孢子自发荧光除了蓝色，还有绿色和红色(图2-B～D)。

A：新鲜休眠孢子自发荧光；B～D：90 ℃水浴处死孢子自发荧光A: Spontaneous fluorescence of fresh dormant spores of Plasmodiophora brassicae; B-D: Spontaneous fluorescence of spores killed by water bath at 90 ℃.图2 根肿病菌孢子自发荧光Fig.2 Spores spontaneous fluorescence of Plasmodiophora brassicae

2.1.3 根肿病菌孢PI染色效果 新鲜休眠孢子悬浮液经 PI 染色后，在荧光显微镜下观察，视野中孢子仅有蓝色荧光(图3-A)；通过90 ℃水浴处理致死的孢子，可观察到既有蓝色也有红色荧光，且孢子堆积成团，无法统计视野中孢子数目(图3-B～C)。

A：新鲜休眠孢子染色后为蓝光；B～C：90 ℃水浴处理孢子染色后为蓝光、红光A: Blue light after staining of fresh dormant spores ; B-C: After dyeing in water bath at 90 ℃, it is blue and red图3 根肿病菌孢子PI染色效果Fig.3 Effect of PI staining on spores of Plasmodiophora brassicae

2.1.4 根肿病菌孢子Hoechest33342染色效果 新鲜孢子悬浮液经Hoechest33342染色后，在荧光显微镜下绝大多数的孢子有蓝色荧光(图4-A)，而少数孢子有红色荧光(图4-B)；经 90 ℃水浴处理致死的孢子，有蓝色和红色荧光，且聚集成团，细胞界限不清晰，无法进行计数(图4-C～D)。

A～B：新鲜孢子染色后多数蓝光(A)和少数红光(B)；C～D：90 ℃水浴处理孢子染色后孢子有蓝光(C)和红光(D)A-B: Most blue light (A) and a few red light (B) were stained with fresh spores; C-D: The dyed spores treated by water bath at 90 ℃ have blue and red light图4 根肿病菌孢子Hoechest33342染色效果Fig.4 Spore dyeing effect by Hoechest33342 of Plasmodiophora brassicae

2.1.5 根肿病菌孢子台盼蓝染色效果 在0.4 %台盼蓝染色后，新鲜孢子悬浮液中死、活孢子呈现不同着色效果。活的孢子圆润透亮、不着色或着色极浅，细胞界限清晰可见(图5-A)；90 ℃水浴处死的孢子全部着深蓝色，染料呈点状或块状沉积在孢子上，且细胞界限清晰可辨(图5-B)；新鲜休眠孢子与90 ℃水浴处死孢子混合后台盼蓝染色，能在同一视野中同时观察到死、活孢子的不同着色效果(图5-C)。

A：新鲜休眠孢子台盼蓝染色呈透亮圆润；B：90 ℃水浴处理染色后深蓝色；C：新鲜休眠孢子和90°水浴处理孢子混合后染色呈现无色+蓝色A: Fresh dormant spores stained with trypan blue were bright and round; B: Dark blue after dyeing in water bath at 90 ℃;C: Fresh dormant spores and spores treated with 90 ℃ water bath were dyed colorless and blue图5 根肿病菌孢子台盼蓝染色效果Fig.5 Effect of trypan blue staining on spores of Plasmodiophora brassicae

2.2 不同药剂对根肿病菌休眠孢子的致死效果

2.2.1 药剂不同处理时间对根肿病菌孢子致死效果 利用台盼蓝对药剂处理后的孢子进行染色，结果显示，不同药剂对根肿病菌孢子处理时间长短其致死率有一定差异。药剂处理7、10、14 d后，随着处理时间延长，孢子死亡率会逐渐增加，致死率高低顺序14 d>10 d>7 d。其中明迪、福帅得、科佳、百菌清和多菌灵处理7～10 d，致死率增加幅度比10～14 d大，其它药剂处理7、10、14 d后，致死率差异不大。

药剂处理7 d后，19种药剂对根肿病菌孢子致死率在12.46～31.18 %，不同药剂间差异不大；处理10 d后，明迪、福帅得、科佳、百菌清和多菌灵致死率明显上升，致死率为41.69 %～56.37 %，其它药剂致死率为13.07 %～33.21 %，与处理7 d的效果比较差异不明显；处理14 d后，19种药剂致死效果与处理10 d的致死率差异不大。通过药剂对根肿病菌孢子不同处理时间效果比较，表明处理时间需在10 d以上才能检测和体现药剂对根肿病菌休眠孢子的致死效果(图6)。

图6 不同处理时间对根肿病菌孢子的致死效果差异Fig.6 The difference of lethal effect of different treatment time on spores of Plasmodiophora brassicae

2.2.2 不同药剂处理根肿病菌致死效果 不同药剂处理后，采用台盼蓝染色法染色，在荧光显微镜下计数，统计药剂对病菌孢子的致死率。药剂处理14 d测定结果显示，不同药剂种类之间对根肿病菌孢子致死效果有明显差异，明迪、福帅得、科佳、百菌清和多菌灵的致死率为55.99 %～62.49 %，致死效果较好；咪鲜胺、明安、烯酰吗啉、甲霜灵锰锌的致死率为31.66 %～33.89 %，有一定抑制效果；多抗霉素、克菌康、明彩、明登、代森锰锌、甲基硫菌灵、腐霉利的致死率为20.79 %～25.49 %；而春雷霉素、明润丰和明农心致死率较低，为17.89 %～19.49 %(图7)。

图7 不同药剂处理对根肿病菌的致死效果Fig.7 Lethal effect of different agents on Plasmodiophora brassicae

3 讨 论

3.1 根肿病菌孢子染色效果比较

采用荧光显微镜观察根肿病菌孢子，由于孢子在荧光显微镜下自带荧光，给实验带来一定困难。通过根肿病菌孢子不同染色方法比较实验，显示台盼蓝染色后可以在同一视野中，明显区分根肿病菌休眠孢子是死的还是活的：有活力的休眠孢子透亮、不着色，死的休眠孢子着深蓝色，二者颜色反差强烈，且死的休眠孢子无聚集现象。与其他染色方法相比，台盼蓝染色为根肿病菌休眠孢子活力检测的最佳方法。因此该实验以下染色测定均用台盼蓝染色。台盼蓝染液染色为根肿病菌休眠孢子活力检测的最佳方法。根据多次的实验确定染色的最佳比例为处理液∶台盼蓝(9∶1)，最佳染色时间为3～5 min。该实验结果对根肿病菌孢子的相关研究奠定了基础。

3.2 不同药剂及处理时间对根肿病菌孢子致死效果

19种药剂及不同处理时间对根肿菌孢子的抑制率测定，结果显示，随处理时间延长，致死效果逐渐增高，部分药剂致死率在处理第7 ～10天，变化幅度较大，所有药剂在处理10～14 d时，致死效果变化不大。其中明迪、福帅得、科佳、百菌清和多菌灵等对孢子致死效果较好，均高于55 %。多抗霉素、克菌康、春雷霉素、明润丰、明登、明农心、代森锰锌和甲基硫菌灵等致死效果较差，药剂致死效果与大田药剂防控效果基本相吻合。

4 结 论

通过实验表明杀菌剂在防治根肿病菌时具有一定的时间性和滞后性，所以生产实际中防治十字花科根肿病要提前施药或采取预防措施，才能达到最佳防控效果。在田间根肿病的药效试验比室内复杂，影响因素较多，在不同地理条件下，同样的防控方法、防控药剂产生的效果会差异。同时对根肿病的防控仅用单一药剂防控措施远远达不到持续控制目标，长期单一使用核心药剂会使病原菌产生抗药性，因此必须采用综合的防控措施，以利用抗病品种为基础，加强栽培管理，清理病根降低菌源量，健康种苗及土壤处理、关键药剂防治等持续控制，才能逐渐减轻根肿病的发生危害。