强冬性甘蓝型冬油菜抽薹相关基因SVP和SOC1的克隆与表达分析

王祺 蒲媛媛 赵玉红 孙柏林 金姣姣 王万鹏 牛早霞 刘丽君 马骊 武军艳 方彦 李学才 孙万仓

摘要：甘蓝型冬油菜（Brassica napus L.）的冬前抽薹对北方冬油菜生产是极为不利的。SVP（Short vegetative phase）和SOC1（Suppressor of overexpression of constans 1）是与甘蓝型冬油菜抽薹及生长相关的同源基因，为揭示甘蓝型冬油菜抽薹机制，以甘肃农业大学育成的强冬性甘蓝型冬油菜16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10为试验材料，对SVP和SOC1克隆和表达情况进行分析。核酸序列分析结果表明，强冬性甘蓝型冬油菜SVP和SOC1基因的开放阅读框（ORF）长度分别为726 bp和642 bp，分别编码241个和213个氨基酸;2个基因在进化过程中高度保守，屬于MADS-box家族成员，编码的蛋白质均为α-螺旋和卷曲环组成的亲水蛋白质，通过对不同抗寒性材料SVP和SOC1氨基酸序列比较，分别发现了4个和9个氨基酸位点突变。荧光定量（qPCR）分析结果表明，SVP基因在未抽薹植株叶中高表达，在抽薹未现蕾及抽薹现蕾植株叶中低表达;SOC1基因相对表达量的变化趋势与SVP基因相反，抽薹现蕾及成熟植株中的SOC1基因相对表达量较未抽薹植株高。由此推测SVP和SOC1基因可能参与甘蓝型冬油菜抽薹及成花的调控，研究结果可为今后选育强冬性甘蓝型冬油菜晚抽薹抗寒品种提供理论依据。

关键词：甘蓝型冬油菜;抽薹;SVP基因;SOC1基因;基因表达

中图分类号：S332;Q786文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）05-1088-10

Abstract：The pre-winter bolting of Brassica napus L. is extremely disadvantageous to the production of winter rape in North China.SVP （Short vegetative phase） and SOC1 （Suppressor of overexpression of constans 1） are the homologous genes related to bolting and growth in Brassica napus L.. In order to reveal the bolting mechanism of winter rape （Brassica napus L.）， strong winterness Brassica napus L. strains 16VHNTS158， 16VHNPZ269-1 and 16VHTS309-10 bred by Gansu Agricultural University were used as experimental materials to analyse the cloning and expression of SVP and SOC1. The results of nucleotide sequence analysis showed that the open reading frames （ORF） of SVP and SOC1 genes in winter type Brassica napus L. were 726 bp and 642 bp in length， encoding 241 and 213 amino acids respectively. The two genes belonging to MADS-box family are highly conserved in evolution， which encode hydrophilic proteins composed of α-helix and loop. By comparing the amino acid sequences of SVP and SOC1 in different cold-resistant materials， four and nine amino acid site mutations were found respectively. The results of quantitative real-time PCR （qRT-PCR） showed that SVP gene was highly expressed in the leaves of unbolting plants， but lowly expressed in the leaves of bolting plants and budding plants. The relative expression changes of SOC1 gene were opposite to SVP gene. The relative expression of SOC1 gene in budding plants and mature plants were higher than in unbolting plants. It is suggested that SVP and SOC1 gene may be involved in the regulation of bolting and flower formation in Brassica napus L.， the results of this study can provide theoretical basis for the breeding of cold-resistant and late bolting varieties of strong winterness Brassica napus L. in the future.

Key words：Brassica napus L.;bolting;SVP gene;SOC1 gene;gene expression

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是中国重要的油料作物，其播种面积占油菜播种面积的90%左右[1]，但抗寒性差，在35°N左右地区难以越冬[2]。甘蓝型油菜的生长发育特性不同于白菜型油菜，先抽薹、后现蕾，这种生长特性对抵御北方地区的严酷自然环境极为不利，极易遭受冻害的影响[3]。甘蓝型冬油菜抽薹早晚与其抗寒性密切相关，蒲媛媛等[4]的研究结果表明，抗寒性强的甘蓝型冬油菜在春播条件下不抽薹，春化率低，绝大部分植株只进行营养生长;而抗寒性弱的材料，春化率较高，会出现抽薹、抽薹现蕾以及开花等处于不同生长发育阶段的植株。因此，研究甘蓝型冬油菜晚抽薹的分子调控机制，对甘蓝型冬油菜的抗寒育种具有重要意义。SVP和SOC1都是MADS-box家族成员，SVP是重要的开花抑制基因，参与花分生组织的形成，并调节开花途径中关键基因SOC1的表达，从而调控开花[5]。Hartmann等[6]研究发现，SVP 基因在拟南芥早花突变体的营养组织和花原基中表达，对抽薹开花具有抑制作用。Tang等[7]发现，在拟南芥中过表达LoSVP基因的转基因植株较对照延迟6 d开花，说明LoSVP基因对抑制拟南芥开花具有重要作用。王世祥等[8]发现，随着苹果花芽的不断分化，SVP表达量逐渐下调，表明 SVP基因可能抑制苹果成花诱导。大麦SVP基因异位表达引起成花阻遏[9];水稻中SVP基因在营养生长阶段稳定表达，而在生殖生长阶段表达量有不同程度的减少[10]。SOC1基因不仅调控开花时间和参与花器官形态建成[11-12]，也是光周期、春化途径、自主途径、赤霉素途径等开花路径的主要调控信号整合因子[13]。Heuer等[14]在玉米中克隆到SOC1的同源基因ZmMADS1，并证明该基因与开花相关。Shitsukawa等[15]在小麦中克隆到WSOC1，发现在拟南芥中过表达WSOC1基因提前了转基因植株的开花时间。Zhong等[16]在大豆中克隆到拟南芥SOC1同源基因GmGAL1，发现其主要作用是作为开花途径的关键调节因子，与拟南芥中SOC1同源基因功能相似。SVP和SOC1对强冬性甘蓝型冬油菜生长发育的影响尚未见报道。本研究以甘肃农业大学育成的强冬性甘蓝型冬油菜16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10为试验材料，研究SVP和SOC1对甘蓝型冬油菜生长发育的影响，探究SVP和SOC1基因在甘蓝型冬油菜抽薹、现蕾以及成花过程中的作用，为强冬性甘蓝型冬油菜晚抽薹抗寒品种选育提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

以甘肃农业大学选育的16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10等3个不同抗寒性的强冬性甘蓝型冬油菜品系为参试材料（表1）。试验于2018年在甘肃省永登县上川镇甘肃省油菜工程中心试验基地进行，试验点位于36°03′N、103°40′E，海拔2 150 m，最大冻土深度113 cm，最冷月平均气温-8.1 ℃，最冷月平均最低气温-14.6 ℃，极端最低气温-28.0 ℃[17]。2018年3月21日播种，行距20 cm，株距8～10 cm，小区面积4 m2，3次重复，于8月24日对3个冬油菜品系的植株生长发育状态进行调查取样分析。

取样：3个冬油菜品系小区内的植株处于未抽薹、抽薹未现蕾、抽薹现蕾及结角成熟4种生长发育状态。（1）对处于不同发育阶段的植株叶片进行取样，包含未抽薹植株叶片、抽薹未现蕾植株叶片、抽薹现蕾植株叶片以及结角成熟植株叶片。（2）对植株的不同组织器官进行取样，对同一植株的叶、蕾、花3个组织部位分别进行取样。取样后用液氮速冻，用于RNA提取和基因克隆等试验。

1.2甘蓝型冬油菜叶、蕾及花的总RNA提取与反转录

根据植物总RNA提取试剂盒DP419[天根生化科技（北京）有限公司产品]提取步骤分别提取甘蓝型冬油菜叶、花蕾及花的总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性并用NanoPhotometer Pearl测定浓度。用PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）反转录试剂盒（大连TaKaRa公司）进行反转录，得到cDNA，置于- 20 ℃冰箱保存备用。

1.3SVP和SOC1基因的克隆

从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中得到与甘蓝型油菜相似性为100%，位于A09染色体上的SVP和位于C04染色体上的SOC1的CDS（编码序列），利用Primer Premier 5.0设计SVP和SOC1基因的克隆引物（表2）。以16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10未抽薹植株叶片的cDNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCR）进行体外扩增，扩增程序为：98 ℃預变性2 min;98 ℃变性10 s;SVP基因退火温度为55 ℃，退火15 s;SOC1基因退火温度为58 ℃，退火15 s;72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit）对目的片段进行切胶回收，与pMDTM19-T克隆载体进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37 ℃培养12 h，筛选蓝白斑并进行菌液PCR验证，最终挑选3个阳性克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.4基因的生物信息学分析

应用DANMAN软件对克隆基因进行多重序列对比和氨基酸同源性分析，用NCBI的ORF finder分析氨基酸序列，利用Protparam在线软件分析氨基酸理化性质，包括氨基酸数目、理论等电点、相对分子质量[18]，利用ProtScale在线软件分析蛋白质的亲水性和疏水性[19]，利用NCBI（Conserved Domain Search）分析蛋白质保守结构域，利用TMpred在线软件分析蛋白质跨膜区特性，利用SignalP 4.0 Server预测蛋白质信号肽，利用SOPMA在线工具进行蛋白质二级结构预测，利用SWISS-MODEL预测蛋白质三级结构，利用MEGA 7.0软件构建系统进化树[20]。

1.5基因的表达分析

试验采用实时荧光定量法（qPCR），分析SVP和SOC1在不同发育阶段下甘蓝型冬油菜植株叶片、花蕾及花中的相对表达量，基因相对表达量参照Pfaffl法[21]进行计算。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物（表2）。根据TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒（TaKaRa，大连）进行qPCR试验，以 Actin为内参基因[22]，反应条件为：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。熔解程序：95 ℃15 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s。扩增效率计算：将cDNA稀释为50.000 ng/μl、25.000 ng/μl、12.500 ng/μl、6.250 ng/μl和3.125 ng/μl的质量浓度后作为模板进行扩增，利用Excel 2016绘制标准曲线后，进一步计算得到扩增效率。

1.6数据分析

采用Excel 2016、Origin 2018和SPSS 22.0统计分析软件进行数据分析与作图。

2结果与分析

2.1甘蓝型冬油菜SVP基因和SOC1基因的克隆

以16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10叶片的cDNA为模板，设计特异性引物并通过PCR分别获得大小约为720 bp的SVP和640 bp的SOC1（图1）。切胶回收后连接至pMDTM19-T载体，转化大肠杆菌后进行蓝白斑筛选，菌液经PCR鉴定后挑选阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2.2甘蓝型冬油菜SVP蛋白和SOC1蛋白的生物信息学分析

2.2.1SVP蛋白和SOC1蛋白的理化特性

2.2.1.1SVP蛋白的理化特性通过NCBI查询SVP的开放阅读框，发现该基因序列中含有大小为726 bp的完整开放阅读框，编码241个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。分别对从16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10克隆到的SVP基因所编码的蛋白质进行了理化性质分析，如表3所示，SVP蛋白属于不稳定蛋白质。对克隆到的3个SVP基因所编码的蛋白质进行亲水性、信号肽、保守结构域、跨膜区、蛋白质二级结构及三级结构预测，发现3个蛋白质的分析结果一致，因此，接下来主要以16VHNTS158中克隆到的SVP基因所编码的蛋白质进行分析。SVP蛋白具有13个亲水区和7个疏水区，具有保守的MADS结构域和K-box结构域，该蛋白质氨基酸序列中不存在信号肽切割位点，但含有2个跨膜区域，蛋白质二級结构和三级结构预测结果显示， SVP蛋白主要由α-螺旋和卷曲环组成。

2.2.1.2SOC1蛋白的理化特性通过NCBI查询SOC1的开放阅读框，发现该基因序列中含有大小为642 bp的完整开放阅读框，编码213个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。分别对从16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10克隆到的SOC1基因编码的蛋白质进行理化性质分析，如表4所示，SOC1蛋白属于不稳定蛋白质。对克隆到的3个SOC1基因所编码的蛋白质进行亲水性、保守结构域、信号肽、跨膜区、蛋白质二级结构及三级结构预测，发现3个蛋白质的分析结果一致，因此，接下来主要以16VHNTS158中克隆到的SOC1基因所编码的蛋白质进行分析。SOC1蛋白有13个亲水区和7个疏水区，具有保守的MADS结构域和K-box结构域，该蛋白质不存在信号肽切割位点，无跨膜区。蛋白质二级结构及三级结构预测结果表明，SOC1蛋白主要由α-螺旋和卷曲环组成。

2.2.2SVP蛋白和SOC1蛋白氨基酸序列比对

2.2.2.1SVP蛋白氨基酸序列比对通过DNAMAN软件对克隆到的SVP基因所编码的蛋白质氨基酸序列比对发现，16VHNTS158和16VHNPZ269-1的蛋白质氨基酸序列相似性为100.00%，与16VHTS309-10的相似性为98.34%，比较16VHNTS158和16VHNPZ269-1与16VHTS309-10的SVP蛋白氨基酸序列发现，存在4个氨基酸位点突变。将克隆到的SVP基因所编码的蛋白质氨基酸序列与NCBI数据库中甘蓝型油菜和拟南芥的SVP蛋白氨基酸序列进行多序列比对发现，16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10与甘蓝型油菜的相似性分别为99.59%、99.59%、97.93%，与拟南芥的相似性分别为92.12%、92.12%、91.29%（图2）。

2.2.2.2SOC1蛋白氨基酸序列比对采用DNAMAN软件对克隆到的SOC1基因所编码的蛋白质氨基酸序列比对发现，16VHNPZ269-1和16VHTS309-10的相似性为100.00%，与16VHNTS158的相似性为95.77%，比较16VHNPZ269-1和16VHTS309-10与16VHNTS158的SOC1蛋白质氨基酸序列发现，存在9个氨基酸位点突变。将克隆到的SOC1基因所编码的蛋白质氨基酸序列与NCBI数据库中甘蓝型油菜和拟南芥的SOC1蛋白氨基酸序列进行多序列比对发现，16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10与甘蓝型油菜的相似性分别为96.24%、99.53%、99.53%，与拟南芥的相似性分别为91.12%、94.39%、94.39%（图3）。

2.2.3SVP蛋白和SOC1蛋白系统进化树分析

2.2.3.1SVP蛋白系统进化树将SVP基因在16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10中所编码的SVP蛋白氨基酸序列与甘蓝型油菜、甘蓝等8个物种的SVP蛋白同源氨基酸序列构建系统进化树（图4），DNAMAN软件分析结果显示，16VHNTS158、16VHNPZ269-1与甘蓝型油菜SVP基因编码的蛋白质氨基酸序列的相似性均为99.59%，与甘蓝、萝卜的相似性达到98.76%、97.93%，与烟草属的相似性为54.36%。16VHTS309-10与甘蓝型油菜、甘蓝、萝卜的SVP蛋白氨基酸序列的相似性分别达到97.93%、98.76%、96.27%，与烟草属的相似性为54.36%。由此推测SVP基因在16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10、甘蓝型油菜、甘蓝等十字花科植物中的功能相似，与烟草属植物的功能差异较大。

4結论

本研究从甘蓝型冬油菜16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10中克隆到SVP和SOC1基因，基因相对表达量分析结果表明，在强冬性甘蓝型冬油菜中，SVP基因在未抽薹植株中的表达量高于抽薹未现蕾及抽薹现蕾植株，SOC1基因在抽薹未现蕾及抽薹现蕾植株中的表达量高于未抽薹植株。由此推测SVP可能对未抽薹特性具有调控作用，SOC1在调控甘蓝型冬油菜抽薹中的作用与SVP相反，具有负向调控作用。比较不同抗寒性材料SVP和SOC1核苷酸序列，分别发现了4个和9个氨基酸位点突变，而这些位点的突变是否改变了甘蓝型冬油菜的抗寒性还有待进一步研究。

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（责任编辑：陈海霞）