Irisin对多囊卵巢综合征大鼠卵巢胰岛素抵抗的影响

周丽，李成刚，巫小云，冯泽怡

1 湖北医药学院附属东风医院，湖北十堰442000；2 湖北医药学院药学院；3 十堰市中西医结合医院

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病，是一种发病多因性、临床表现多态性的内分泌失调综合征，以月经失调、排卵障碍、雄激素过多、高胰岛素血症和胰岛素抵抗为主要特征。PCOS确切的发病机制尚未完全阐明，国内外也未形成统一、有效的治疗方案，使之成为当今妇科内分泌领域研究的热点和难点。据报道，约70%的PCOS患者合并胰岛素抵抗。因此，胰岛素抵抗被认为是PCOS的重要病理生理特征[1]。近年研究发现，PCOS患者的胰岛素抵抗不仅存在于骨骼肌、脂肪、肝脏等经典的胰岛素靶组织或器官，也可存在于多囊卵巢组织内，有可能是卵巢功能障碍的重要机制之一[2-4]。鸢尾素(Irisin)是近年新发现的一种由肌肉组织分泌的细胞因子，具有促进白色脂肪棕色化和提高能量消耗的作用。YE等[5]认为，运动、能量代谢与胰岛素抵抗密不可分，尤其是在2型糖尿病中。有研究证实，Irisin可降低血糖水平，改善胰岛素抵抗，有可能成为治疗2型糖尿病的一个潜在靶点[6-7]。此外，Irisin还能参与其他代谢相关性疾病的发生、发展，如代谢综合征、非酒精性脂肪肝、糖尿病肾病等，并认为其作用机制可能是通过减轻胰岛素抵抗实现的[8-9]。但Irisin能否改善PCOS患者卵巢胰岛素抵抗尚不清楚。2018年1月—2019年7月，本研究观察了Irisin对PCOS大鼠卵巢胰岛素抵抗的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠45只，SPF级，4周龄，体质量70～90 g，由湖北医药学院动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK2016-0008。采用独立通风笼具分笼饲养，饲养环境温度22～25 ℃，相对湿度60%～70%，光照12 h明暗交替。所有大鼠正常摄食和饮水。实验过程符合动物伦理学要求。重组人Irisin，购自北京百奥莱博科技有限公司；注射用脱氢表雄酮(DHEA)，购自湖北远程药业有限公司。全波长酶标仪，购自芬兰雷勃公司；PCR仪，购自美国Bio-Rad公司。大鼠胰岛素ELISA试剂盒，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。胰岛素受体底物2(IRS-2)、葡萄糖转运子4(Glut4)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)p85α单克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠二抗，购自武汉华美生物工程有限公司。TRIzol、逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 动物分组与干预 所有大鼠适应性饲养3 d，经阴道涂片观察，将有正常动情周期大鼠纳入实验。采用随机数字表法随机将大鼠分为对照组、模型组、Irisin组，每组15只。模型组、Irisin组每日颈背部皮下注射DHEA 0.06 mg/g+0.2 mL注射油剂，对照组每日颈背部皮下注射等体积油剂，连续20 d；第21天开始，Irisin组每日腹腔注射重组人Irisin 100 ng/g，对照组和模型组每日腹腔注射等量生理盐水，连续14 d。

1.3 血清胰岛素检测 模型组建模成功次日，对照组和Irisin组同期，采集清晨空腹状态下眼眶静脉血，3 000 r/min离心15 min、离心半径15 cm，取上层血清，采用ELISA法检测血清胰岛素。各组末次腹腔注射后6 h处死，采集腹主动脉血，3 000 r/min离心15 min、离心半径15 cm，取上层血清，采用ELISA法检测血清胰岛素。所有操作严格按ELISA试剂盒说明进行。

1.4 卵巢组织IRS-2、Glut4、PI3K p85α表达检测 无菌条件下摘取双侧卵巢，置于-80 ℃冰箱冻存。右侧卵巢组织用于IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白表达检测，左侧卵巢组织用于IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA表达检测。①IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白表达检测：采用Western blotting法。取右侧卵巢组织，剪碎后加入含苯甲基磺酰氟的裂解液，冰上充分裂解。4 ℃、12 000 r/min离心20 min，离心半径15 cm，取上清，经BCA法蛋白定量合格。根据蛋白浓度，调整上样量，加入上样缓冲液，100 ℃水浴使蛋白充分变性，以40 μg/孔在10% SDS-PAGE凝胶上电泳(100 V，2 h)。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF膜，然后用5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入IRS-2、Glut4、PI3K p85α单克隆抗体(稀释比均为1∶1 000)和内参β-actin一抗(稀释比1∶1 500)，4 ℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠二抗(稀释比1∶3 000)，常温孵育1 h。ECL发光，暗室中曝光、显影，采用凝胶成像分析系统采集各蛋白电泳条带灰度值。以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。②IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA表达检测：采用RT-qPCR法。取左侧卵巢组织，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。取总RNA 1 μg，以Oligo DT为引物，按PrimeScript RT Reagent Kit说明将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA为模板，按Real-time PCR试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列：IRS-2上游引物5′-TGACCAGTCCCACATCAGGC-3′，下游引物5′-CTGCACGGATGACCTTAGCG-3′；Glut4上游引物5′-CTGTTGCCCTTCTGTCCTGA-3′，下游引物5′-CAACTTCCGTTTCTCATCCTTCA-3′；PI3K p85α上游引物5′-GGTGAGGAACGAAGAATGGC-3′，下游引物5′-TCCGAGGCAAGACAGGGATA-3′；β-actin上游引物5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。PCR反应体系共50 μL：Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2.5 μL，DNA模板 5 μL，灭菌双蒸水15 μL；反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共35个循环，最后72 ℃ 10 min。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 各组血清胰岛素水平比较 见表1。

表1 各组不同时间血清胰岛素水平比较

2.2 各组卵巢组织IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白表达比较 见表2。

表2 各组卵巢组织IRS-2、Glut4、PI3K p85α蛋白相对表达量比较

2.3 各组卵巢组织IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA表达比较 见表3。

表3 各组卵巢组织IRS-2、Glut4、PI3K p85α mRNA相对表达量比较

3 讨论

PCOS是育龄期女性的常见病、多发病，是以高雄激素血症、稀发排卵或无排卵、卵巢多囊样改变等为主要表现的内分泌失调综合征。文献报道，约70%的PCOS患者合并胰岛素抵抗，同时其胰岛素敏感性降低35%～40%，与非胰岛素依赖型糖尿病女性相似，故PCOS患者常常发展为代偿性高胰岛素血症[1]。由此可见，PCOS的发病机制与胰岛素抵抗密切相关。以往研究认为，PCOS卵巢功能障碍的发病机制与外周经典靶组织或器官的胰岛素抵抗导致代偿性高胰岛素血症对卵巢的作用有关。高胰岛素环境下，卵巢间质合成雄激素增多[2]；在卵巢内，胰岛素可引起窦前卵泡发育停滞，也可引起颗粒细胞凋亡[10-11]。但近年研究发现，PCOS卵巢也存在胰岛素抵抗和糖代谢异常，这可能是导致PCOS卵巢功能障碍的重要机制[4]。近年研究发现，PCOS卵巢胰岛素受体数量及其与配体亲和力均未发生改变，而胰岛素受体底物IRS-1、IRS-2表达和磷酸化异常[12]，提示PCOS卵巢胰岛素抵抗是胰岛素受体信号结合后缺陷。胰岛素受体底物IRS-1优先调节胰岛素信号的促有丝分裂途径，而IRS-2主要调节胰岛素的代谢通路[13]。胰岛素与受体结合后使受体激活，激活的受体可使IRS-2酪氨酸磷酸化，而磷酸化的IRS-2进一步通过PI3K、Glut4、Ras/MAPK等一系列信号传导过程实现葡萄糖信号的跨膜转运。因此，影响胰岛素受体反应链中的任何一个环节均可导致胰岛素抵抗。

Irisin是BOSTROM研究团队于2012年发现的一种肌源性细胞因子，由骨骼肌分泌，是Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5经蛋白水解酶水解后形成的可分泌多肽片段。Irisin几乎分布于机体所有的组织和器官，如骨骼肌、心脏、大脑、脂肪等[14]。Irisin在骨骼肌合成后迅速释放入血，诱导具有存储作用的白色脂肪转化为具有产热作用的棕色脂肪，从而增加能量消耗，减轻体质量。随着研究的不断深入，学者们逐渐发现，Irisin还可通过内分泌作用参与能量代谢紊乱相关性疾病，如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心脑血管疾病等[8-9]。有研究证实，Irisin可降低血糖水平，改善胰岛素抵抗[5-7]。因此，以胰岛素抵抗为重要内分泌改变的PCOS与Irisin的关系成为近年研究的热点。有研究报道，PCOS患者多伴有Irisin水平改变，并认为Irisin可作为早期诊断PCOS的指标[15]。MASAELI等[16]研究报道，PCOS患者外周血循环Irisin水平与胰岛素抵抗相关指标呈正相关关系，并认为Irisin可作为评估PCOS患者胰岛素抵抗程度的指标。BOUSMPOULA等[17]研究发现，PCOS患者血清和卵泡液中Irisin水平均高于正常女性。有研究还发现，Irisin能够促进卵巢颗粒细胞雌二醇分泌[18]，提示Irisin可能对卵巢功能具有一定影响。但其作用机制鲜见报道。

本研究结果发现，PCOS大鼠血清胰岛素水平升高，卵巢组织IRS-2、Glut4、PI3K p85α表达降低，证实PCOS除了伴随全身胰岛素抵抗外，也存在卵巢局部胰岛素抵抗。本研究还发现，通过Irisin干预，PCOS大鼠血清胰岛素水平下降，卵巢组织IRS-2、Glut4、PI3K p85α表达较模型组升高，提示Irisin除了改善PCOS高胰岛素血症外，还可通过增加胰岛素受体后信号通路活化，改善卵巢胰岛素抵抗。这为探索Irisin对卵巢功能的影响提供了新的方向，同时为PCOS治疗提供了新的靶点。本研究Irisin组卵巢组织IRS-2、Glut4、PI3K p85α表达未达到对照组水平，可能与卵巢胰岛素信号通路尚未恢复至正常有关。持续给予Irisin腹腔注射能否恢复正常的胰岛素信号通路，将是我们今后研究的重点。

综上所述，Irisin能够改善PCOS大鼠卵巢胰岛素抵抗，其作用机制可能是通过增加卵巢胰岛素抵抗相关信号分子IRS-2、Glut4、PI3K p85α表达实现的。但Irisin是通过何种机制引起PCOS卵巢胰岛素抵抗相关信号分子表达增加的尚需进一步研究。