GATA4基因慢病毒载体构建与鉴定

张帆，厍广岩，钟浩，马伟，宗渊，武建英

1 青海大学，西宁810016；2 青海大学附属医院

先天性心脏病(CHD)是指在胚胎发育时期心脏和大血管形成障碍或发育异常所致的先天性畸形。目前，CHD的成因尚不明确，遗传因素可能是其形成的重要原因，尤其是基因单核苷酸多态性(SNP)位点突变[1-3]。锌指转录因子4(GATA4)是人类CHD的致病基因之一。流行病学调查发现，GATA4外显子基因突变可引起CHD，并且其发病率在不同民族间具有明显统计学差异[4-5]。GATA4基因H436Y位点突变可明显提高汉族人群房间隔缺损(ASD)、室间隔缺损(VSD)的发病率[6]。在VSD患者中能够检测到GATA4基因p.S335X位点突变[7]。以上研究提示，GATA4基因突变与CHD的发病密切相关，但目前对其机制尚不完全清楚。2019年3月—2020年4月，本研究构建了GATA4基因慢病毒载体并转染293T细胞，观察了GATA4在体外的转录水平，为进一步阐明GATA4基因突变导致CHD的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人源胚胎肾细胞293T(以下称293T细胞)，购自上海弘顺生物科技有限公司；DH5α感受态细胞，购自日本TaKaRa公司。pMGic7.1载体，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。VSVG-GFP质粒、pCMV-dR8.9包装质粒，购自美国Addgene公司。引物序列设计合成和阳性克隆测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。Annealing Buffer for DNA Oligos (5×)，购自碧云天生物技术(上海)股份有限公司。Taq酶、dNTP，购自日本TaKaRa公司；T4 DNA ligase，购自加拿大Fermentas公司；AgeI-HF、EcoRI-HF，购自美国NEB公司。兔抗人GATA4单克隆抗体、β-actin一抗，购自美国Proteintech公司；鼠抗兔二抗，购自美国Santa Cruz公司。

1.2 RNAi慢病毒载体构建 将pMGic7.1载体置于38 ℃恒温水箱，用AgeI-HF、EcoRI-HF酶切。酶切体系：pMGic7.1载体4 μL，AgeI-HF内切酶4 μL，EcoRI-HF 4 μL，Annealing Buffer for DNA Oligos (5×) 4 μL，ddH2O补足至20 μL。经琼脂糖凝胶电泳回收目标条带。

利用siRNA软件(http://design.RNAi.jp/)设计2条目的基因靶序列，序列1：5′-CCGGGACTTCTCAGAAGGCAGAGAGCTCTCTGCCTTCTGAGAAGTC-

TTTTTTG-3′、序列2：5′-AATTCAAAAAAGACTTCTCAGAAGGCAGAGAGCTCTCTGCCTTCTGAGAAGTC-3′，得到siRNA重组载体，分别标记为PLVE2636-1、PLVE2637-1、PLVE2638-1和PLVE2636-2、PLVE2637-2、PLVE2638-2，作为实验组，然后进行PCR扩增。PCR扩增体系共50 μL：Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，上下游引物各1 μL，质粒模板1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1 μL，ddH2O补足至50 μL；反应条件：98 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s循环30次，72 ℃ 100 s，72 ℃ 8 min，4 ℃ 10 min。

转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，挑取菌落鉴定。PCR反应体系共20 μL：10×PCR Buffer(with Mg2+) 2 μL，dNTP 1.6 μL，模板1 μL，Taq酶0.1 μL，上游引物(5′-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3′)0.8 μL、下游引物(5′-CTATTAATAACTAATGCATGGC-3′)0.8 μL，ddH2O补足至20 μL；反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、75 ℃ 50 s、70 ℃ 6 min共循环30次，最后10 ℃ 10 min。将反应产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.3 慢病毒包装 将293T细胞接种于含10% FBS、1%青链霉素双抗、1%谷氨酰胺的完全培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。当细胞生长融合80%左右时，吸弃上清液，加入等体积完全培养基。将混合物移至10 mL离心管，依次加入GATA4载体质粒100 μg、VSVG-GFP质粒35 μg、pCMV-dR8.9包装质粒65 μg，Trans-EZ溶液500 μL，用完全培养基补足至5 mL。室温下孵育30 min，用25 mL移液器移至培养板中，8 h后移除上清液，加入等体积完全培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。持续培养48 h，收集上清液，高速离心后PVDF膜过滤上清液，浓缩病毒原液，-80 ℃保存。

1.4 病毒滴度测定 按10倍梯度稀释病毒原液，取3个1.5 mL EP管，每管加入完全培养液90 μL，然后向第1个EP管中加入病毒原液10 μL，充分混匀；吸取第1个EP管中病毒稀释液10 μL，加入第2个EP管中，充分混匀；吸取第2个EP管中病毒稀释液10 μL，加入第3个EP管中，充分混匀。通过公式，计算病毒滴度。病毒滴度(IU/mL)=(C×N×D×1 000)/V。其中，C为平均每基因组整合的病毒拷贝数，N为感染时细胞的数目(约1×105个)，D为病毒载体的稀释倍数，V为加入的稀释病毒体积。

1.5 慢病毒转染293T细胞 体外常规培养293T细胞。取传2代、对数生长期、生长状态良好的293T细胞，消化后计数，制成密度为5×104个/mL细胞悬液。将细胞悬液接种于6孔板，每孔2 mL，随机分为实验组(PLVE2636、PLVE2637、PLVE2638)、空白对照组、阴性对照组，每组设3个复孔，常规培养24 h。293T细胞的最佳感染复数(MOI)为10。根据公式：病毒体积=(MOI×细胞数)/病毒滴度，计算需要加入的转染病毒体积。转染24 h，加入Polybrene，培养48 h后更换新的培养基，倒置荧光显微镜(100×)下观察荧光标记细胞。

1.6 GATA4蛋白和mRNA表达检测 ①GATA4蛋白表达检测：采用Western blotting法。取传2代、对数生长期、生长状态良好的293T细胞，经细胞裂解液裂解，提取细胞总蛋白。蛋白定量合格后，加入上样缓冲液，100 ℃水浴10 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白20 μg，SDS-PAGE分离，将蛋白电泳产物转印至PVDF膜，10%脱脂奶粉室温封闭6 h，加入兔抗人GATA4单克隆抗体、β-actin一抗，4 ℃孵育过夜。次日加入鼠抗兔二抗，室温孵育4 h。DAB显影，Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。②GATA4 mRNA表达检测：采用RT-qPCR法。取传2代、对数生长期、生长状态良好的293T细胞，根据RNAiso Plus总RNA抽提试剂盒说明提取细胞总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。按One ShineTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit说明，将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。按TaKaRa PCR试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列：GATA4上游引物5′-CTCTACATGAAGCTCCAC-3′、下游引物5′-CTGCTGGTGTCTTAGATT-3′，β-actin上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′、下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCAC-3′。PCR反应体系共10 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板 2 μL，RNase-Free ddH2O 2 μL；反应条件：90 ℃ 40 s，95 ℃ 5 s、65 ℃ 40 s共40个循环，95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算GATA4 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 RNAi慢病毒载体鉴定 pMGic7.1载体经AgeI-HF、EcoRI-HF酶切，回收载体大片段，片段长度约8.2 kb。将GATA4干扰片段连接入表达载体，经PCR鉴定，实验组(PLVE2636、PLVE2637、PLVE2638)转化单斑长度为260 bp，经生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对比siRNA序列，证实pMGic7.1载体与序列1正确连接，其基因序列如下：CGAAACACCGGGGACATAATCACTGCGTAATCC-TCGAGGATTACGCAGTGATTATGTCCTTTTTTG-AATTCGGA(黑体部分为siRNA干扰序列)，符合实验要求。

2.2 慢病毒包装与病毒滴度测定结果 实验组(PLVE2636、PLVE2637、PLVE2638)持续培养24 h，显微镜下观察细胞融合接近70%时，可见GFP标记；培养48 h，可见60%以上细胞贴壁生长，细胞内逐渐形成多核体。显微镜下观察病毒原液，明视野下病毒生长良好，结构完整，GFP标记较多，亮度高，呈现“满天星”现象。显微镜下观察病毒10倍稀释时，明视野清晰，无杂质，病毒生长良好，结构完整，病毒密度下降，GFP标记较病毒原液减少，亮度降低。显微镜下观察病毒100倍稀释时，明视野下病毒生长良好，与病毒原液相比，单个病毒形态变化不大，包膜完整，但每视野下GFP标记明显减少，呈“星空”现象。经测定，病毒拷贝数随稀释倍数增加而降低，但病毒滴度变化不大，即病毒效价变化不大。结果见表1。

表1 实验组病毒滴度测定结果

2.3 慢病毒转染293T细胞鉴定 维持Polybrene浓度5 μg/mL转染48 h，GFP标记基本稳定。转染72 h，显微镜下观察，293T细胞生长状态良好，无核破裂、核溶解。空白对照组因未添加目的基因片段，无荧光标记；阴性对照组和实验组荧光标记达峰，但阴性对照组满视野可见荧光标记，而实验组荧光标记明显少于阴性对照组。根据病毒感染率=荧光细胞数/明视野细胞数×100%，实验组病毒感染率为(81.345±1.173)%。

2.4 各组GATA4蛋白和mRNA表达比较 GATA4蛋白大小约45 kDa，空白对照组未添加目的基因，在45 kDa处无蛋白条带。阴性对照组和实验组(PLVE2636、PLVE2637、PLVE2638)均可见目的基因蛋白条带。实验组GATA4蛋白相对表达量为0.739±0.056，阴性对照组为0.997±0.001。实验组GATA4蛋白相对表达量低于阴性对照组(t=6.600，P<0.05)。

实验组GATA4 mRNA相对表达量为0.362±0.024，阴性对照组为0.998±0.001，空白对照组为0.812±0.001。实验组GATA4 mRNA相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组(t分别为36.653、27.401，P均<0.05)。

3 讨论

CHD是小儿最常见的出生缺陷性疾病。流行病学调查发现，目前我国新生儿CHD的发病率为2.9‰，较10年前明显提高，男婴高于女婴，主要以VSD为主。CHD的发病机制至今仍不完全清楚，但遗传因素和环境因素已被证实是其主要病因。

有研究证实，GATA4是人类CHD的致病基因之一。GATA4属于GATA家族，其基因定位于人染色体8p22-23，cDNA全长3 371 bp，C-末端和N-末端的锌指结构能够与DNA稳定转录因子连接[8]，从而在心肌发育和成熟过程中发挥重要作用[9]。GATA4通过Wnt信号通路控制心脏结构形成，正向增强心肌蛋白活性，协同HDAC2参与心肌细胞增殖，同时亦参与心肌细胞凋亡[10-11]。有研究对比41例动脉导管未闭(PDA)患者与342例健康志愿者DNA序列，发现PDA患者存在GATA4基因rs372504711位点突变，经关联分析得出GATA4基因TT、CT基因型者PDA患病风险明显高于CC基因型者[12]。有研究发现，GATA4基因rs4841587位点突变与CHD有一定相关性，rs4841587位点T/G多态性与VSD的易感性和病情程度密切相关[13]。有研究报道，在GATA4序列中家族性ASD患者存在非同义位点变异，如c.839 C>T(T280M)，该位点虽然在CHD患者普遍存在，但在健康儿童中不存在此位点突变[14]。GATA4可在体内持续表达，但在不同阶段对心肌的作用具有特异性。在大鼠心肌梗死模型中，提高GATA4表达可有效降低心肌纤维化，减少瘢痕组织代偿性。在心肌炎症病变期，炎症因子可诱导GATA4高表达，从而促进心肌重塑、心肌纤维化，增加氧化应激和心脏重构易感性并参与房颤发生[15-16]。目前关于GATA4与CHD的关系仅涉及流行病学、SNP位点等方面，对其具体机制尚不明确。

本研究通过RNAi技术构建GATA4慢病毒载体并转染293T细胞，多途径观察了GATA4在体外的表达水平。RNAi通过同源双链RNA诱导沉默特定序列，从而影响其功能性表达，因其具有快速、高效、精准等特点，已被广泛用于分子基础研究。运用siRNA在线软件设计2条目的基因靶序列，连接载体后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，证实pMGic7.1载体与第1条siRNA序列正确连接，其原因可能在于设计siRNA时避开了胞嘧啶和鸟嘌呤富集区，避免了重复序列，防止甲基化对碱基互补配对的干扰[17]。慢病毒载体被认为是进行RNAi的最佳搭档，与一般载体相比，目的基因在慢病毒中稳定存活且慢病毒可转染处于各生长周期的载体细胞，而被转染的载体细胞不会因慢病毒的存在而影响传代和增殖，在反转录体系中较为稳定[18]。慢病毒转染293T细胞后，荧光显微镜下持续观察发现，维持Polybrene浓度5 μg/mL转染48 h，阴性对照组和实验组GFP标记逐渐增多；转染72 h，慢病毒载体中荧光标记细胞比例达到高峰，在此过程中空白对照组持续无GFP标记，而阴性对照组GFP标记最多。GATA4蛋白大小约45 kDa。本研究空白对照组在45 kDa处无蛋白条带，阴性对照组因未添加siRNA片段，GATA4蛋白未受抑制，蛋白条带明显，而实验组蛋白条带亮度明显低于阴性对照组。进一步分析蛋白条带灰度值发现，实验组GATA4蛋白相对表达量低于阴性对照组；通过RT-qPCR技术分析发现，实验组GATA4 mRNA相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组。结果证实，目的基因已被抑制。

综上所述，本研究成功构建了靶向GATA4基因的慢病毒载体，并进一步证实CHD的致病基因GATA4在体外可被有效抑制。