黄连上清片微生物限度检查法的建立

张秀花，刘艳平，曲国晶

(菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽)

0 引言

黄连上清片收载于《中华人民共和国药典》(以下简称：《中国药典》)2015年版一部[1]，清风清热、泻火止痛，临床应用广泛。由于黄连上清片中多种药材如黄连、黄芩、大黄、连翘、栀子等均具有明显的抗菌活性[2-10]，进行微生物限度检查时，需要首先消除样品本身的抑菌作用，才能使被检生物能够正常繁殖[11]。作者对6家生产企业6个批次的样品进行试验，结果微生物计数采用增加稀释液法，控制菌检查采用常规法，该方法操作简单，重现性好，可供其他实验室参考使用。

1 仪器与材料

1.1 样品

安徽九方制药有限公司(批号：190401)，福建乐尔康药业

有限公司(批号：190128)，河南金鸿堂制药有限公司(批号：20181105)，洛阳天生药业有限责任公司(批号：190405) 乐氏同仁三门峡制药股份有限公司(批号：20190107)，仲景宛西制药股份有限公司(批号：20191101)。

1.2 培养基与稀释液

胰酪大豆胨琼脂培养基TSA(批号：190518)，胰酪大豆胨液体培养基培养基TSB(批号：190712)，沙氏葡萄糖琼脂培养基 SDA(批号：190625)，肠道菌增菌液 EE(批号：180222)pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：190206)等均由北京陆桥技术股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

按药典要求[12]将5种菌株依法制成不大于1000cfu/mL的菌液。

2.2 供试液制备

取“1.1”项下样品10g，研细，加入“1.3”项下稀释液至100mL，制成1:10 供试液；依法制成1:20、1:50、1:80[13]、1:100、1:1000 的供试液。

2.3 微生物计数试验

2.3.1 常规法

取“2.1”项下菌液0.1mL至9.9mL“2.2”项下1:10供试液中，为试验组；取稀释液0.1mL至9.9mL“2.2”项下1:10供试液中，为供试品对照组；取“2.1”项下菌液0.1mL至9.9mL稀释液中，为菌液对照组。

2.3.2 增加稀释液法

取“2.1”项下菌液0.1mL至9.9mL“2.2”项下1:20供试液中，为试验组；取稀释液0.1mL至9.9mL“2.2”项下1:20供试液中，为供试品对照组；取“2.1”项下菌液0.1mL至9.9mL稀释液中，为菌液对照组。1:50、1:80供试液依法操作。

表1 常规法预试验结果(n=3)

2.4 微生物计数结果

2.4.1 预试验

常规法测定5种菌株回收比，按“2.3.1”项下操作，平皿计数结果见表1。

由表1可以看出，不同企业生产的黄连上清片抑菌活性不同，针对本次试验的6家生产企业的样品，无法统一采用常规法进行试验；不同生产企业的样品对5种菌株的敏感性不同，其中对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性较强，回收比均小于0.5，可将这3种菌株作为敏感菌株进一步进行试验。

2.4.2 需氧菌总数计数方法的确定

根据预实验结果，选用上述3种菌株作为敏感菌株，采用增加稀释液法试验，按“2.3.2”项下操作，平皿计数结果见表2。

由表2可以看出，稀释倍数不同，供试液的抑菌性不同，稀释倍数越大，抑菌性越小。1:20供试液，6批样品中均存在回收比小于0.5的敏感菌株；1:50供试液，2批样品存在回收比小于0.5的敏感菌株；1:80供试液，6批样品5种菌株回收比均在0.5～2.0之间，符合药典要求。

2.4.3 正式试验

根据“2.4.1”及“2.4.2”项下确认的结果，采用增加稀释液法进行试验，按“2.3.2”项下操作，1:80供试液平皿计数结果见表3。

由表3可以看出，6批样品5种菌株回收比均在0.5～2.0范围内，符合药典要求，方法可行。

表2 敏感菌株回收比试验结果(n=3)

表3 黄连上清片方法适用性试验结果(n=3)

表4 黄连上清片控制菌检查结果

2.5 控制菌检查试验

2.5.1 耐胆盐革兰阴性菌

供试品组：取“2.2”项下 1:10、1:100、1:1000供试液各1mL分别至10mL及20mLEE中；阳性对照：取“2.2”项下1:10、1:100、1:1000供试液各1mL分别至10mL及20mLEE中，再加入“2.1”项下相应阳性菌0.1mL；阴性对照：以稀释液代替供试液，以上各组依法检查。

2.5.2 大肠埃希菌

供试品组：取“2.2”项下1:10供试液10mL至100mL及200mLTSB中；阳性对照：取“2.2”项下1:10供试液10mL至100mL及200mLTSB中，再加入“2.1”项下大肠埃希菌0.1mL；阴性对照：以稀释液代替供试液，以上各组依法检查。

2.5.3 沙门菌

供试品组：取“1.1”项下样品10g至100mL及200mLTSB中；阳性对照：取“1.1”项下样品10g至100mL及200mLTSB中，再加入“2.1”项下乙型副伤寒沙门氏菌0.1mL；阴性对照组：以稀释液代替供试液，以上各组依法检查。控制菌检查结果见表4。

由表4可以看出，常规法可用于黄连上清片控制菌检查。

3 讨论

微生物限度检查法最初收载于《中国药典》1995年版，2005年版首次引入方法验证试验，2015年版修订为方法适应性试验。从历年药典的修订情况可以看出，药品的安全性越来越受到重视。微生物污染指标菌检出与否，关键在于使用的计数方法是否有效，检查的重点和难点在于方法适用性试验的建立[14-17]；当检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验[18]。

从表1可以看出，常规法6家生产企业的样品对5种菌株的抑菌性均不同。针对这一问题，首先将回收比小于0.5的菌株作为敏感菌株，采用增加稀释液的方法，逐渐增加稀释倍数，至所有敏感菌株的回收比均在0.5～2.0之间。从表3可以看出，1:80供试液，各试验菌回收比均在0.90以上，表明方法可行。

由于黄连上清片中抑菌成分复杂，考虑到对控制菌的抑菌作用，本试验采用常规法和增加培养基体积法同时进行控制菌检查，结果表明黄连上清片对控制菌无抑制作用，常规法可用于控制菌的检查。