鼠心房颤动模型现状及小鼠转录调控心房颤动模型的运用*

戴玮然 钟国强

既往在体大动物心房颤动(简称房颤)动物模型构建主要包括药物诱导房颤模型(乌头碱、乙酰胆碱、氯化铯等)、创伤性重塑房颤模型(二尖瓣返流、无菌性心包炎、急性心房缺血等)以及电刺激房颤模型(心房快速起搏、食管调搏以及迷走神经刺激等)三大类,其中心房快速起搏最被学界认可。而程序性长期心房快速起搏可以模拟房颤心动周期,被广泛应用于构建慢性房颤。近年来不同基因工程鼠房颤模型进入大众视野,其通过基因敲除或改建方式构建特异性差异表达基因后模拟房颤发生相关病理生理环境,为深入了解房颤发生和维持的具体分子机制提供了新的研究平台。转录是DNA 形成互补m RNA 过程,同时是中心法则关键步骤,通过转录调控可以直接干预功能蛋白合成及表达。笔者特以鼠房颤模型现状及小鼠转录调控房颤模型运用进展进行综述。

1 鼠房颤模型现状

鼠科动物具有体积小、妊娠期短、成熟快等特点,且相对容易实现基因修饰,已经成为一个有吸引力的哺乳动物实验平台,并广泛用于建立多种临床疾病模型。但既往“临界心脏质量”理论认为鼠科动物缺乏产生心律失常的必须心脏质量[1],以及非人灵长类大型哺乳动物和狗的心脏更接近人类,鼠作为心律失常模型研究相对较少。但随着上述理论被推翻、新型实验器材小型化以及人源化鼠模型研究进展,为鼠房颤模型建立提供了坚实的理论基础。

目前,建立小动物房颤模型的三大主要方法为心房快速起搏、药物诱导及基因修饰。因鼠类动物心脏体积较小,实用性植入式心房起搏器模拟房颤心动周期尚未得到广泛应用。但随着食管调搏电极小型化,其可通过食管壁放电快速起搏心房诱导房颤成为目前闭式起搏建模的主要方法。国内学者经食管调搏电极行快速心房起搏有效建立SD 大鼠房颤模型,且具有可重复性及周期短的特点[2]。而经超声引导食管调搏电极定位临近右房食管壁,缩小了起搏电极到右房距离,其建立大鼠快速心房起搏房颤模型更为准确、有效[3]。经食管调搏电极快速起搏心房同样可诱导小鼠房颤[4－5]。Chen等[6]报道经食管电极采用Burst模式(30 Hz)突发性短期(3 s)间隔刺激心房起搏成功诱导小鼠房颤,并发现CD44敲除有助于降低小鼠电刺激房颤发生。另有研究延长食管调搏电极脉冲起搏持续时间(＞5 min)同样成功稳定诱导小鼠房颤发生[7]。此外,国外少量文献报道经静脉入径放置心房快速起搏电极建立大鼠房颤模型。Yamashita等[8]在系统麻醉SD 大鼠后分离右侧颈总动脉,置入2F鞘管建立直通右房通道,由鞘管置入1.5F四极电极行右房程序起搏成功建立阵发性大鼠房颤模型。由于其避免了食管壁组织对电信号测量的影响,静脉置入电极房颤造模可更精确测量右房有效不应期(AERP)和单相动作电位(MAP)等电生理检测指标。与此同时,经外鞘转接换能器探头尚能评估房颤发生时心房血流动力学变化,因而更适用于短期房颤血栓形成机制研究[9]。但因静脉入径存在置管损伤和术后感染风险,静脉置管房颤造模术后存活率可能低于食管调搏房颤造模,且不利于多次诱导造模。目前尚无文献直接对比两种电刺激造模方法优劣性,在选择具体实验方案时应熟悉两种方案检测特点,视本实验研究方向及要求选择合适的房颤电刺激造模方案。

在药物诱导建模方面,氯化钙-乙酰胆碱(CaCl2-Ach)混合溶液诱导自发性房颤模型近年来被广泛报道,其可能机制与钙调控异常及自主神经功能失调有关[10]。钙调控异常参与心肌细胞异位放电、局部折返形成以及心房结构重构过程,其在房颤过程中发挥了重要的致心律失常作用。由于心房迷走神经分布不均,Ach 引起迷走神经异常兴奋,造成AERP离散程度增加,从而增加心房电信号折返敏感性,继而诱发房颤[11]。季芳等[12]早期报道在CaCl2-Ach 给药40天后成功建立了稳定大鼠房颤模型。张婉桐等[10]以CaCl2-Ach尾静脉注射方式连续给药39 天成功建立大鼠房颤模型,而进一步检测发现房颤组大鼠AERP 明显缩短伴随心肌组织Cav1.2钙通道蛋白表达下降。钙通道异常是心房电重构和房颤发生与维持的重要因素[13],Cav1.2钙通道蛋白作为钙信号中关键通道蛋白,其表达下降促进动作电位时程(APD)缩短诱导房颤发生[14]。因此,从侧面验证了CaCl2-Ach大鼠房颤模型有效性。陈春林等[15]改良CaCl2-Ach诱导自发性房颤造模时间为7天,并通过梯度设置CaCl2-Ach混合溶液药物浓度的方法,以成功率和死亡率为联合评价指标,成功筛选CaCl210 mg/m L,Ach 66 ug/m L 为诱导大鼠自发性房颤最适浓度。此改良造模方案因造模时间短,AERP缩短明显,给药期间内即可观察到自发性房颤表现,同时具有较高造模成功率和低死亡率,特别适合于全新化合物抗房颤活性的筛选及作用机制的初步研究。Zou等[16]学者通过CaCl2-Ach改良方案成功建立大鼠房颤模型,并验证了氧化应激和线粒体损伤参与了房颤发生和维持过程。在小鼠上,CaCl2-Ach混合溶液经球后静脉注射途径同样可在第4天后诱导稳定自发性房颤[17]。

基因修饰建立房颤模型在近年来呈发展态势,其在基因层面进行靶向修饰,保持了遗传稳定型的同时也最大限度排除了个体差异和外界因素对实验结果的干扰。2002年小鼠基因组测序发现小鼠与人类在基因水平上具有高度同源性[18],且小鼠较大鼠更容易在目前基因工程层面在出生前实现基因修饰,因而成为转录调控房颤模型的主要研究平台。下文即以小鼠为主要描述对象介绍几种转录调控房颤模型构建方式。

2 小鼠转录调控房颤模型

2.1 环磷酸腺苷(c AMP)反应元件调节器 c AMP 反应元件调节器属于c AMP 依赖的c AMP 反应元件结合蛋白(CREB)/c AMP反应元件调节子(CREM)/转录激活因子(ATF)家族转录因子之一,同时也是蛋白激酶A(PKA)的磷酸化靶点。c AMP反应元件调节器及其结合蛋白通过介导转录激活c AMP依赖基因调控机制,将c AMP 依赖的信号通路与细胞的转录活性紧密联系起来。CREM-IbΔC-X是人类心脏CREM 抑制因子亚型,其最初在心力衰竭患者心肌组织中被发现[19]。通过NheI/NotI定向酶切方式将标记的CREM-IbΔC-X cDNA 切取后克隆到p TRE-2质粒产生中间构建体,再用KpnI/XhoI定向酶切中间构建体加入到含有鼠心脏MHC基因启动子片段载体中转染小鼠从而建立CREM-IbΔC-X 转 基 因 小 鼠[19]。CREM-IbΔC-X 心 脏 定向表达可导致小鼠发育过程中出现心房异位、心房和心室增大、心房壁变薄、心肌细胞结构紊乱以及左心室功能异常等病理状态[20]。更为重要的是,在过表达CREM-IbΔC-X 后,转基因小鼠可形成自发性房颤,通常在第8周可观测到,并随着时间推移由阵发性房颤发展为持续性房颤[21]。因而,CREM-IbΔC-X 转基因小鼠可模拟阵发性房颤到持续性房颤渐进的、年龄依赖性的转变,有助于更加深入探究房颤患者疾病进展规律及内在生物活性标记物变化机制及其与房颤的关系。CREM-IbΔC-X 过表达引起此种病理改变可部分归因于其增加促心律失常的底物形成,包括心房结构改变(心房扩张和纤维组织异常堆积为主要表现),传导速率减慢和增加的Ca2＋肌浆网渗漏影响心肌细胞钙稳态失衡等[21]。最新研究表明CREM-IbΔC-X 过表达可抑制CREM 磷酸化,伴随有自发Ca2＋释放和缝隙连接蛋白(Cx)40表达降低导致心肌间电信号传导异常并最终引起心房电重构[22－23]。

为了进一步探究CREM-IbΔC-X 转基因小鼠自发性房颤机制,Kirchhof等[22]通过对比野生型小鼠与转基因小鼠心脏随时间变化,发现CREM-IbΔC-X 转基因小鼠在3至5周龄即可经超声心动图检测到进行性心房扩张并导致10周龄时心房直径增加三倍以上。同时,7周龄时CREM-IbΔCX 转基因小鼠的心房重量增加[(8.5±0.9)mg vs(4.9±0.9)mg]伴随心功能下降。此研究证明了CREM-IbΔC-X 转基因小鼠心房和房室扩张先于房颤的发生,为详细探究房颤发生机制和后续干预实验提供新的研究思路。在探究CREMIbΔC-X 转基因小鼠左右房组织中促血栓形成机制研究中,Bukowska等[24]选取20周龄CREM-IbΔC-X 转基因小鼠与野生型小鼠进行对比,发现CREM-IbΔC-X 转基因小鼠左右心房中都存在组织血栓,且右房更明显(58%),而在同龄野生型小鼠中未发现血栓形成。与此同时,电子显微镜分析显示CREM-IbΔC-X 转基因小鼠中心肌内皮受损伴随富含胶原蛋白和纤维蛋白凝块形成,合并PAI-1与tPA 的m RNA比值明显升高,其直接反映血栓形成风险增加。因而CREM-IbΔC-X 转基因小鼠房颤模型还有助于研究房颤时心房血栓形成机制及其病理生理条件。由于CREM-IbΔCX 转基因小鼠房颤模型在通常情况下存活时间短于正常小鼠,转基因干预条件复杂且不易培养稳定亲本,广泛推广仍需进一步改良。

2.2 微小核糖核酸(miRNAs) miRNAs是一类内生的,长约20～24个核苷酸构成的单链非编码小RNA 序列,其通过与特定靶m RNA 的3’非编码区完全或不完全互补结合,促进靶mRNA 降解或抑制其翻译从而在转录后水平调控蛋白表达。Lu等[25]通过微阵列组织芯片检测房颤患者及犬电刺激房颤模型心房组织miRNA 转录组差异发现miR-328明显升高,提示miR-328可能参与心房重构而增加房颤易感性。在后续动物验证实验中,miR-328过表达转基因小鼠经αMhc启动子调控出现麻醉下自发性房颤,相反小鼠经miR-328基因敲除有效逆转自发性房颤发生,直接证明miR-328是房颤发生的重要分子机制[25]。进一步体外细胞膜片钳检测发现自发性房颤miR-328转基因小鼠心肌细胞的APD 较野生型小鼠心肌细胞明显降低,可能是自发性房颤发生的原因[25]。而Ca2＋离子流动是影响APD 的重要因素,结合生物信息学验证结果,CACNA1C 及CACNB1 基因分别编码L型钙通道α1c和β1 亚基,同时也是miR-328 的直接靶基因[26],miR-328过表达通过靶向抑制机制导致L 型钙通道组成亚基合成减少,引起L 型Ca2＋电流降低和APD 缩短,继而诱发房颤[25]。因此,miR-328 通过转录调控离子通道蛋白表达诱导自发性房颤,并可由此建立miR-328过表达转基因小鼠房颤模型。

Callis等[27]以4月龄miR-208a基因敲除小鼠和野生型同窝小鼠为研究对象,报道了大约80%的miR-208a敲除小鼠出现自发性房颤,进一步组织蛋白检测发现Cx40蛋白水平较野生型小鼠明显降低,提示miR-208a可能通过影响心脏电信号传导诱发房颤。通常Cx43 在整个心脏的心肌细胞中表达,而Cx40表达仅限于心房和构成His束和浦肯野纤维的特化心肌细胞,当Cx43 和Cx40 的缺陷可导致心脏传导缺陷并诱导房颤发生[28]。本课题组前期研究发现编码Cx40的GJA5基因与miR-208a-3p存在潜在靶向结合位点,且两者在房颤患者右心耳组织中表达存在负性调控关系,遗憾的是荧光素酶验证实验证明GJA5 不是miR-208a-3p的直接靶基因[29]。GATA4是在成人心脏的心脏传导系统内表达的重要转录辅因子并参与Cx40表达[30]。通过生物信息学序列信息比对发现GATA4编码m RNA 的3＇UTR 含有预测结合miR-208a靶位点,而双荧光素酶报告基因验证了GATA4是miR-208a的直接靶基因,因而miR-208a是通过靶向抑制GATA4,从而抑制心脏传导系统相关因子合成后下调Cx40表达,继而诱导房颤发生[27]。因此,miR-208a敲除转基因小鼠可作为转录调控小鼠房颤模型。

2.3 Jun二聚蛋白2(JDP2) 既往研究表明核转录因子作为重要转录调节节点,其参与心脏发育及其功能调节。JDP2是一种属于bZIP 家族的转录抑制因子[31],其在心力衰竭方面研究广泛且被确定为心肌梗死后发生心力衰竭的预后标志[32]。小鼠过表达JDP2可加重心功能障碍并促进心肌肥厚[33]。而JDP2在房颤机制中的研究相对较少,Kehat等[34]研究发现过表达JDP2 导致小鼠双房扩张以及Cx40、Cx43、肌球蛋白轻链2表达缺失,并引起房室传导缺陷,并在少数JDP2 转基因小鼠中出现自发性房颤,而在消除JDP2过表达后上述异常被逆转。JDP2过表达调控Cx43和Cx40表达下降,继而影响心肌细胞间电信号传导,因此Cx缺失也可能是JDP2过表达导致所观察到的心肌电信号传导缺陷的原因之一。而在房颤结构重构中,心房扩张为最为重要房颤危险因素之一。有研究表明,在患者中左房内径每增大5 mm,患者房颤风险增加39%[35]。此外,心房扩张诱导血管紧张素Ⅱ等生物活性因子释放增加,并诱导心肌纤维化发生和心肌纤维间质增生,最终诱导房颤发生。

2.4 核孔蛋白155(NUP155) 核孔复合体位于细胞核内,能促进和直接筛选DNA 和m RNA 从细胞核向细胞质的运输,通过干预核孔复合体能在转录后水平有效调控下游蛋白表达。NUP155是核孔复合体重要组成部分,其编码基因位于5号染色体短臂13 区域(5p13)。在早期临床病例研究中,NUP155突变相关的临床病例提示NUP155突变携带者与新生儿房颤以及早期猝死有关[36]。而在缺失NUP155的小鼠中同样能观测到自发性房颤[37],因而NUP155被认为和房颤具有高度相关性。为了进一步研究NUP155参与房颤 相 关 机 制,Zhang 等[38]通 过 构 建 NUP155 ＋/＋、NUP155-/-与NUP155＋/-转基因小鼠,其中NUP155 敲除小鼠早期即出现死亡,NUP155 杂合子较纯合子小鼠NUP155表达下降并出现自发性房颤。进一步分离鉴定出NUP155与房颤相关纯合子突变型R391H,其在小鼠体内编码影响合成NUP155 核定位,并导致膜通透性减弱从而干扰核信号有效向核外传递,在转录后水平调控蛋白表达,最终引起房颤[38]。

核纤层蛋白(Lamin)是细胞核中参与微结构构建和调控转录的纤维蛋白。而Lamin A/C(LMNA)突变可导致家族性扩张型心肌病,临床表现可为早发房室传导阻滞和室上性心律失常[39]。Han 等[40]通过免疫共沉淀证明NUP155与LMNA 之间存在相互作用关系,而Arg399Cys能有效减弱NUP155与LMNA 之间的相互作用并诱发房颤,从侧面证明NUP155在房颤发生中扮演重要角色。此外,有研究表明NUP155影响心房电信号传导并最终导致临床房颤发生,因而被确定为房颤的临床驱动因素之一[38]。近期,有学者发现NUP155与组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)存在相互作用,因此房颤心律失常表型也可能是转录活性改变的结果[41]。

2.5 转录相关增强因子-1(RTEF-1) RTEF-1转录系统在多种生理病理条件下发挥重要作用,其中以介导内皮细胞增殖及血管生成方面研究广泛。有证据表明,RTEF-1通过刺激血管内皮生长因子(VEGF)的表达,在缺氧条件下调控血管生成[42]。Cx37、Cx40和Cx43受RTEF-1的调控,作为黏附位点以增强内皮细胞的连接和聚集,促进血管网络的及时形成[43]。此外,RTEF-1是针对心脏、骨骼和平滑肌细胞中表达的许多基因的启动子[44],还是α1肾上腺素能信号转导的转录靶点。但RTEF-1相关房颤模型研究相对较少,Chen等[45]通过将人类RTEF-1 在小鼠心脏特异性过表达,观测到小鼠自发性房颤的发生,其中经Burst起搏刺激幼龄小鼠房颤诱发率明显提高,而在12个月龄转基因小鼠中出现持续性房颤。在后续细胞实验中,RTEF-1转基因心肌细胞之间的细胞染料转移实验证实细胞水平的信号传导受损,这可能是RTEF-1过表达小鼠出现心律失常的原因[45]。进一步验证实验发现此传导缺陷与Cx40和Cx43的去磷酸化以及蛋白磷酸酶1(PP1)上调有关,RTEF-1调控异常经上调PP1引起Cx40及Cx43异常或缺失,最终导致心肌电传导异常和诱导房颤发生[45]。此外,有研究报道对比野生型小鼠,RTEF-1转基因小鼠在4月龄即可观察到明显的心房扩张,而在10月龄时许多RTEF-1转基因小鼠出现严重的血栓形成现象和猝死现象[45]。

3 结束语

总体而言,房颤模型小型化联合基因工程可能为今后房颤模型潜在发展方向,鼠房颤模型具有造模周期短、操作流程方便、易于基因修饰和更真实模拟房颤患者疾病进展状态等特点。转录水平调控小鼠房颤模型构建,受基因工程技术及存活率影响,CREM-IbΔC-X 转基因小鼠为目前最具有实际使用意义的转录水平调控小鼠房颤模型。我们期待新的并可进一步广泛推广的基因修饰小鼠房颤模型的出现,以期更好地探究房颤及其并发症相关机制。