物理化学方法合成类牙釉质材料的研究进展

张凌云 孙倩男 张云帆 彭丽颖 吕汶諠 余婷婷 韩 冰

一、牙釉质结构及其性能分析

牙釉质具有复杂的结构，主要由约1～2mm厚的羟基磷灰石晶体组成[1]。在过饱和离子环境下，蛋白质之间和蛋白质与矿物质之间相互作用产生了优先沿C轴生长的高度有序的羟基磷灰石晶体束[2]，约30nm厚，60nm宽[3]（由于成像局限性，文献间数据差异大：如，另有文献说横截面大致为矩形[4]，平均宽度为68nm，平均厚度为26nm[5]。）。这些微晶的大小取决于其矿化的阶段：在分泌阶段晶体主要增加长度，在成熟阶段继续增加宽度和厚度。这些微晶进一步经有机分子组装成两种主要结构：釉柱和柱间质。釉柱是由线性排列的细长微晶束组成的结构，横截面为直径约3～5μm的“钥匙孔形”。釉柱之间彼此交叉缠绕[6]，近表面1/3较直，内2/3弯曲，因此釉柱的实际长度大于相应部位釉质的厚度[7]。在某些区域，釉柱还可以扭曲在一起或轻微改变方向[8]，这些增强结构得以承受负荷并通过裂缝偏转抵抗损伤[9]。釉柱由富含蛋白质的薄鞘状釉质包裹，称为柱间质，其排列方向垂直于釉牙本质界，这些釉质结构中的有机成分被认为是牙齿韧性的本质来源。我们可通过羟基磷灰石晶体的方向区分釉柱和柱间质。此外，无釉柱釉质指的是看不到釉柱结构，但电镜下可见晶体相互平行排列的釉质。这种结构主要存在于牙齿切端和牙合面的釉质[10]，近年来研究证明其在釉质结构性能中也发挥重要作用。

牙齿在行使功能时需要承受极大的撞击力和剪切力，最外层的釉质能够在生理承受范围内保护牙齿不受破坏。虽然牙釉质张力强度较小，理论上易碎裂，但其具有较高的弹性系数和韧性足以弥补。研究显示牙合面牙釉质具有比横截面更高的弹性模量，并且测量的样品面积越小则弹性模量越大，同时柱间质的硬度和弹性模量比釉柱的硬度和弹性模量低很多[11]，这些变化反映了釉质的各向异性特性[12]。针对牙釉质的各向异性特性，人们提出了正交各向异性复合模型[12，13]、有限元模型[14]、纳米压痕测量[13]等理论和方法，阐明牙釉质的弹性模量与接触应力场的有效体积和接触面积之间的函数关系：随着接触区域或接触深度的扩大，更多的有机组织被引入应力反应区域，因此整个系统的晶体体积分数减小[12]。此外，牙釉质的抗折性也受微观结构的控制，如釉柱的各向异性取向和有机成分含量。由于牙釉质矿物质含量高，有机物含量低，所以釉质理论上来讲质脆，但釉质断裂韧性优异。釉柱的取向可以在产生裂缝时偏转其方向以防止裂缝延伸到釉牙本质界[15，16]。同时，牙釉质的高韧性也可以通过正交各向异性复合模型来解释，研究证明牙釉质韧性大约是地质羟基磷灰石的三倍[17]。最新研究发现，HA纳米棒之间的无定形晶间相各向同性[18]、内部有极少的晶界和位错[19，20]以及丰富的活性位点[21]，也为釉质优异的机械性能做出贡献[22]。由于釉质层状结构和有机组分的存在，在釉质行使功能过程中集中的应力被大大削弱。总的来说，其高羟基磷灰石含量、复杂的晶体结构及其特殊的排列方式决定了釉质突出的生物力学性能。

牙釉质具有如此独特的组织结构和优异的美观及生物力学性能，但遗憾的是破坏的牙釉质是不可再生的，牙体缺损只能用人工材料修复。然而目前釉质修复材料的发展依然无法满足临床的需求。金属硬度与釉质相似、边缘强度高、变形小，但美观性能较差、部分金属影响影像学检查且少数病例过敏。陶瓷美观、半透明度与牙釉质相似、生物相容性好、化学性能稳定、但材料硬度过大易损伤对颌牙和邻牙，韧性不足容易崩瓷或折裂等等。此外金属和陶瓷共同缺陷在于修复前需要磨除部分健康牙体组织以获得固位和抗力。而树脂需要预备的牙体组织量最小、美观性能优异、临床操作简单，但聚合收缩导致继发龋仍是难题、老化着色影响美观、同时树脂耐磨性不尽人意。多年来人们致力于仿生天然牙釉质，以获得类似牙釉质的硬度、韧性等力学性能同时兼备优异的色泽、透明度等美观性能、良好的界面结合性能以及生物相容性。尽管进展不断，类釉质材料已在临床上得到应用，但目前实现应用的类釉质材料结构非常简单。其中以仿生陶瓷为代表的具有仿生概念的陶瓷，仅在一定程度改善了材料的力学性能，它们的结构精度仍与天然牙釉质存在较大差异[23，24]。故目前类牙釉质材料的主要缺点在于，我们并未能切实将理想的材料性能实现在临床实践应用中。基于细胞途径的生物工程的方法难以突破，原因在于相关细胞的高度分化状态以及釉质高度复杂的生物材料特性。从蛋白质基质方向入手的研究大多数是围绕釉原蛋白进行仿生矿化[25～27]，然而由于蛋白调控牙釉质的形成和矿化是一个极其复杂的过程[28]，机制至今尚未明确，而且需要比较严格的反应条件，因此还需要进一步的研究。此外，酸蚀牙面原位釉质再矿化的方法一直是多年来的研究热点，但大部分再矿化方向研究目前始终不能突破厚度限制，无法应用于临床。但近年来，随着生物、医学、物理、化学等各学科的交叉及综合，人们通过物理方法、化学方法甚至物理化学融合方法，通过从化学成分和结构形态两方面模拟天然牙釉质，合成类牙釉质材料。目前的研究结合材料成分和应用范围，主要从两个思路入手：综合化学成分和结构形态两方面再生牙釉质；仅从结构形态方面模仿天然牙釉质，用丰富多样的优异成分替代羟基磷灰石，以合成类釉质材料。本文将这两种思路分类阐述类牙釉质材料的物理化学合成方法，介绍基本的设计原理和制造方法，并进一步从应用角度对两类合成方法的优缺点、发展前景和机遇进行评述。

二、从成分和结构两方面仿生合成

1.基于表面活性剂处理的沉淀结晶：表面活性剂分子一端为亲水的极性带电基团，另一端常为疏水的非极性烃链[29]。通过静电相互作用其亲水端能紧密与羟基磷灰石的表面结合，其分子外部烃链将羟基磷灰石表面改性为疏水性。这些疏水性纳米棒聚集在一起，能够在水/空气界面处自组装成高度有序的类釉质柱状结构。近年来，越来越多的具有两亲性的分子被尝试用于合成类牙釉质材料，如多库酯钠盐（docusate sodium salt）、聚多巴胺分子[30]、氨基和羧基封端的聚酰胺树枝状大分子等等。这是最早成功合成平行排列的细长釉质状磷灰石晶体的方法。但合成晶体结构小且随机分散，合成条件极端，此外添加的化学物质可能会产生有害的生物效应。

2.螯合剂引导的水热法：水热法是制造长羟基磷灰石纳米棒的有效方法[31]。研究利用金属板、硅片、锌片、斜方铝石等等作为基板[32]，在水热压下向溶液中加入磷灰石并添加螯合剂，即可以获得一层类似牙釉质结构的磷灰石薄膜。此法结晶度高，且避免前法中使用的极端条件如高压、高酸度和有害的成核或乳化条件。但合成过程需要添加大量的化学成分，得到的磷灰石比天然牙釉质晶体小。近年来有学者改良水热法，在不添加任何蛋白质、表面活性剂、有机溶剂的情况下，以斜方铝石为模板，利用磷酸三钠水溶液开发了一种简便的方法来合成类牙釉质HAp纳米棒晶体阵列，钙/磷比高达1.67[33]。

3.模拟体液溶液（simulated body fluid，SBF）浸泡矿化：模拟体液溶液是一种非细胞模拟体液，其离子浓度几乎等于人的血浆[34]。经过表面处理的金属、陶瓷或聚合物浸泡在SBF提供的超饱和环境中即可诱导磷灰石的形成。近年来此法不断完善，研究通过浓缩SBF、合成类似SBF成分的缓冲液等改良方法，在多种仿生矿化模板上合成了高度有序类牙釉质结构，如玉米醇溶蛋白纳米球自组装形成的单层架构模板[35]、珍珠质水溶性基质（water-soluble matrix，WSM）模板[35]、氧化钛基板上的氟代羟基磷灰石涂层[36，37]等等。此法获得的晶体可以大面积沉积，通过表面改型、功能化改良可以实现在各种衬底上都可以沉积，三维的磷酸钙晶体表面结构也可以通过调整来制定矿化条件，然而其结晶度通常较低。

4.釉原蛋白类似物介导的矿化：在非经典结晶理论（non-classical crystallization theory）基础上，通过纳米颗粒的定向附着（oriented attachment）来实现矿化。非结晶理论即有机分子包裹无机纳米晶核形成稳定的无定形矿物[38]，其介导通过自组装和晶体排列以形成宏观晶体的中间体[39]。三步壳聚糖/甘氨酸基合成法在（carboxymethyl chitosan，CMC）/阿仑膦酸盐（alendronate，ALN）基质中，模拟初始釉质发生的关键步骤以获得矿化晶体[40]。近年来多种生物大分子类似物都逐渐被引入国内矿化领域以指导在混合溶剂中形成碳酸钙晶体[41，42]。此法将非经典结晶机制、合成釉原蛋白类似物和模拟生物矿化步骤结合起来为未来改善釉质缺损修复方法带来巨大希望。但合成过程中产生的软质中间材料在咀嚼时尚不能承受牙齿牙合面的咀嚼压力。

5.模拟生物矿化前沿的矿化：受合成条件、合成晶体的尺寸、厚度和性能的限制，在宏观尺度下尚不能实现仿生牙釉质材料的合成。越来越多研究表明，生物矿化发生在晶体生长前沿处的晶体与非晶体界面[43～46]。因此，研究开始关注模拟生物矿化前沿以诱导釉质的外延再生。据报道，Posner簇和磷酸钙离子簇（CPIC）是 ACP 和 HAP 的基本组成部分[39，47～49]。通过稳定地覆盖矿物相，这些超小离子簇可以模拟矿化前沿以诱导釉质的外延再生。然而这些离子簇非常不稳定，在几秒钟内即会聚集成团[48]。针对离子簇的聚集，目前研究合成了多种添加剂稳定的CPIC[50]，其中一种合成方法利用的添加剂是可移除的有机小分子。这种离子簇不仅可以在矿化初期模仿矿化前沿来诱导釉质的外延生长，还可以在矿化成熟过程中被完全去除，从而精确地保持原始结构的复杂性（图7）。然而目前此法合成产物厚度被限制在约2.8um[51]。

三、仅从结构角度仿生合成

1.逐层沉积（layer-by-layer（LBL）assembly）技术LBL工艺是指具有相反电荷的纳米级厚度的单层化合物之间逐层吸附形成多层结构的技术[52]。应用此技术合成的粘土矿物/聚合物纳米多层复合材料的性能优异[53]、成本低廉，因此一直受到特别关注[54]。通过水热法在硅片上沉积ZnO纳米线，然后聚丙烯胺 (polyallylamine，PAAm）和聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA）逐层沉积吸附到ZnO表面[7]，在亲水层上沉积新的ZnO纳米颗粒，如此往复得到类牙釉质材料（ZnO/LBL）n。其阻尼系数极高，成本低，并具有抗老化、高硬度、高刚度、高阻尼及低重量的优势。此外近期还有研究通过将表皮分层结构与氧化石墨烯优异的机械和阻隔性能相结合，尝试实现仿生材料的自修复，性能优异甚至与牙釉质相当。

2.3D打印技术：近期3D打印多级陶瓷技术综述指出该方法可用陶瓷模仿釉质复杂的分层结构[55～58]，通过软相渗透的多级陶瓷支架模拟生物矿物得到多层结构，显示出增强的韧性和抗折裂性[59，60]。为了进一步改良不同相之间的连接界面，Reiser A等利用电液动力学氧化还原印刷技术（electrohydrodynamic redox printing），通过调整打印速度得到的产物在250nm的空间分辨率下化学特征尺寸小于400nm[61]。接下来的工作将致力于减小特征结构的微尺寸，进一步研究增韧策略（例如通过使用其他粒子例如纤维等等），以及探索其他材料性能的匹配结合。

3.冷冻铸造技术：冷冻浇铸是一种技术，通过调整冰晶的生长以实现陶瓷颗粒精密组装，从而生成层级结构。近年来，这种利用散装颗粒有序组装形成层级结构的生物启发性策略受到了极大关注[62]。近期Bouville等采用冷冻铸造技术制造出了一种具有高刚度（290GPa）和强度（470MPa）的分层陶瓷，同时在陶瓷片状颗粒表面引入了低刚度相，从而获得了高韧性（22MPam-1/2）[63]。

4.磁性辅助技术：磁辅助注浆成型法（magnetically assisted slip casting，MASC） 将水基注浆工艺与磁导向颗粒组装相结合，在陶瓷、金属或聚合物功能基质中使用各向异性刚性薄片设计创建程序化微观结构，称为非均质生物复合材料的磁辅助注浆成型法[64，65]。这种技术是生成多层复合材料的有效方法，获得的类牙釉质材料韧性水平与氧化锆相当，弹性模量接近骨和牙本质的硬度，缺陷在于精度不足。这种方法提供了很好的研究方向，目前应用超声辅助共沉淀法已制备出生物安全性良好的纳米羟基磷灰石包覆的磁性纳米粒子[66]。若能赋予羟基磷灰石纳米棒在某种物理场中受控地定向生长并结合注浆成型法，将是仿生牙釉质技术一突破性进展。