生物大分子的“液-液”相分离及其在生理与疾病中的作用

陈娅婧,杨金娥, 中山大学生命科学学院基因功能与调控教育部重点实验室 广东省广州市 510275

0 引言

真核生物的细胞器将细胞分隔为不同的区室,使得细胞内同时进行的各种化学反应互不干扰,从而保证细胞活动的高效有序地进行.除传统的有膜细胞器如内质网、线粒体外,细胞内还有一类无膜的区室结构,如核仁、应激颗粒等,它们也参与到细胞活动的调控,因而又被称为无膜细胞器[1].近年来的证据表明,“液-液”相分离(liquid-liquid phase separation,LLPS)是细胞内无膜区室形成的基础.含有内在无序区域(intrinsically disordered region,IDR)的蛋白质具有发生LLPS的潜质,它们参与调控核仁、应激颗粒等无膜细胞器的形成[2].大量研究结果显示,细胞中LLPS相关蛋白的改变会引起无膜组分的内部性质改变,如凝胶化、固体化等,而这种变化与神经退行性疾病及肿瘤等疾病的发生相关[3].本文就LLPS现象及其在细胞生理与疾病中的作用做一综述.

1 LLPS结构的形成

1.1 相分离是无膜细胞器形成的基础 细胞中的无膜细胞器的形成机制以及其物理化学本质,是困扰了研究者多年的问题.相分离是一个系统的能量降到最低的过程,通常需要分子之间产生相互作用的吸引力驱动他们发生凝聚[3].2009年,Brangwynne等[4]首次将“相分离”的概念引入生物系统中,用于解释秀丽隐杆线虫中生殖颗粒(P granule)不对称分配的问题.他们观察到秀丽隐杆线虫的P granule存在边界清晰的圆形液滴,这些液滴相互接触后可融合成更大的液滴,而且在固体表面可出现润湿的现象.此外,利用荧光漂白及恢复技术,即荧光标记P granule后,使用高能量激光束将细胞内选定区域的荧光淬灭,然后观察邻近相同的荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式,发现局部光漂白后,经过短暂的时间,选定区域的荧光可恢复；而且P granule在应力剪切力的作用下液滴会变形,说明P granule具有较高的流动性.这些特征与体外构建的相分离体系形成的液滴十分一致.考虑到细胞中其他的无膜细胞器也有同样类似的性质,因此作者提出通过LLPS可提供一种特定的方式让细胞内的特定分子聚集起来,从而在混乱的细胞内部形成特定的无膜腔室,为研究无膜细胞器的形成机制提供了全新的思路.

1.2 多价互作驱动LLPS 在细胞中,驱动相分离结构形成的因子通常为大分子化合物,包括蛋白质和核酸等.类似于蛋白质聚集形成淀粉样蛋白颗粒,蛋白质和核酸发生LLPS可能是一种普遍的现象.但是人们发现,只有特定的一部分蛋白质能够在生理或者病理条件下发生LLPS[5].分析这些蛋白质特征发现,它们通常含有IDR[6,7].IDR为一些低复杂度区域(low-complexity region,LCR),其氨基酸构成较为单一,含有少量的芳香族氨基酸,缺乏驱动高阶折叠的结构,如富含丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺等极性氨基酸的朊病毒蛋白样结构域(prion-like domain,PLD)[8,9].另一类LCR为RNA结合蛋白中常见的RGG结构域,富含精氨酸[10].这些结构域通过介导分子间电荷-电荷,π-π和阳离子-π相互作用来促进分子间的多价相互作用,从而驱动相分离结构的组装.2012年Li等[11]发表工作,揭示Nephrin、Nck 接头蛋白(Nck adaptor protein,Nck)和神经Wiskott -Aldrich综合征蛋白(neural Wiskott-Aldrich syndrome protein,N-WASP)组成的肌动蛋白调控信号通路中,Nephrin可通过磷酸化酪氨酸与Nck的多折叠串联重复序列SH3m和N-WASP的富脯氨酸基序相互作用形成多价互作的网络,最终形成相分离结构.此外,RNA、蛋白的修饰如甲基化、磷酸化、泛素化等过程,都可产生新的结合位点,形成多价结合.如mRNA的N6-甲基腺嘌呤甲基化修饰(N6-methyladenosine,m6A)可在RNA上增加多个m6A阅读蛋白yt521-b同源结构域家族蛋白的结合位点,从而驱动LLPS发生[12].从已有的结果来看,蛋白质-蛋白质,蛋白质-RNA以及RNA-RNA之间的多价作用都能驱动相分离发生.

2 LLPS结构的形成及稳定性调节

当细胞中的生物大分子浓度达到形成相分离的所需的最低浓度,即饱和浓度时,即有可能发生相分离.转录、翻译、蛋白质和核酸的修饰等这些影响生物大分子浓度以及结合状态的细胞活动,均可能调控相分离的过程.2019年Söding等[13]提出了相分离结构形成和稳定性调节的模型:Localization-Induction model及Enrichment-Inhibition model.这两种模型都通过调节蛋白的修饰,进而调控大分子之间的相互作用,最终影响生物大分子凝聚体的形成和稳定性.

当细胞中蛋白浓度小于饱和浓度的时候,不能自发形成相分离结构.在这种情况下,细胞通过Localization-Induction model调节蛋白的修饰,如磷酸化、糖基化.修饰后的蛋白进一步通过多价互作聚集,从而提高局部蛋白浓度,促进相分离的发生.在DNA损伤修复过程中,PARP-1蛋白对自身和其靶标蛋白进行多聚ADP核糖修饰,进而与含RGG结构的带正电的蛋白(如FUS)多价互作,促进相分离结构的形成.类似地,T细胞信号转导过程中,观察到经磷酸化修饰的蛋白通过多价互作,被招募到膜上的ZAP70激酶上[14,15],参与形成相分离结构,也间接证实了Localization-Induction model的存在的可能.

当生物大分子的浓度高于饱和浓度时,细胞通过Enrichment-Inhibition model调节相分离结构的稳定性.此时,由于液相区室中富集激酶,相分离关键驱动蛋白磷酸化加强,因此液滴中磷酸化蛋白的浓度高于液滴外.为避免浓度过高导致生物大分子溶解及液滴解体,被磷酸化的蛋白通过自由扩散离开液滴,并在液滴外去磷酸化；而未磷酸化蛋白则通过自由扩散进入液滴,在液滴内被磷酸化,从而形成动态调节回路,保持液滴大小稳定在一定范围.该模型与线虫胚胎细胞中P granule的调节机制比较吻合:MEG蛋白是促进胚胎P granule组装的驱动蛋白,当它被磷酸酶PPTR-1去磷酸化时,可促进P granule组装.而P granule中的MBK-2激酶使MEG蛋白磷酸化时,促进P granule的分解[16].除此之外,应激颗粒[17]、核旁斑[18,19]、Cajal小体[20]以及突触小泡[21]的调节也符合该模型.虽然以上模型较好地解释了相分离结构形成和稳定性调节的机制,但是目前仍缺乏直接的实验证据揭示细胞中存在这两种动态过程,因此细胞中的真正情况仍有待探讨.

除了上述两种主动调节机制之外,近年来还发现mRNA在低浓度的时候可以作为LLPS发生的驱动力,而高浓度的mRNA则会引起相分离结构稳定性下降及相分离组分解聚[22].因此有研究者认为,通过调节相分离关键组分的转录或翻译[16,22,23],从而调节相分离结构的形成、大小或者数量,是另一种相对缓慢但却更为基本的相变调节模式.

3 LLPS结构的生理功能

LLPS可以驱动细胞的区域化,各种无膜细胞器,如细胞核中的核仁、Cajal小体、核旁斑等以及细胞质中的P-body、应激颗粒等,它们的形成均离不开LLPS.此外,异染色质[24]、核孔复合体中的运输通道[25]和细胞膜上的膜受体簇[15]等亚细胞结构也通过LLPS形成.相分离结构参与到各种各样的细胞生理活动中,是细胞复杂功能网络中重要的一部分.

3.1 相分离与基因表达调控 2017年Hnisz等[23]发现在基因的超级增强子处,转录因子和转录起始复合物可形成大分子凝聚物,具有相分离结构的特征.在c-Myc等已知的具有超级增强子结构的基因启动子上游,都可以观察到具有相分离特征的大分子凝聚物形成[26].当干扰相分离结构的组装,则会造成基因转录水平下降[27,28].此外,通过调控RNA聚合酶II的C-端结构域的磷酸化,可调整转录起始复合物相分离结构中募集的成分,从而促进启动子逃离,启动转录延伸[29,30].相分离还可促进了异染色质的形成,导致基因沉默[31,32].以上研究结果提示相分离可通过遗传与表观遗传水平,参与调控基因表达.2019年Cai等[27]发现,高渗胁迫的条件下,转录因子YAP在细胞质和细胞核都能形成相分离结构.在胞质中,这些液滴协助YAP进行核转位,有利于它入核发挥转录因子的功能.在细胞核中,YAP液滴可以重塑基因组,从而促进YAP靶基因的表达,以抵抗高渗胁迫环境.这个现象也提示,相分离结构可以调控细胞应激行为.

更有趣的是,有研究者发现,DNA损伤导致的断裂双链DNA会募集转录起始延伸所需复合物,从而以断链为模板转录合成DNA损伤特异诱导表达的lncRNAs,驱动MDC1、53BP1等DNA修复相关蛋白发生相分离,形成DNA损伤修复位点,提示相分离在DNA损伤修复中也扮演重要角色[33,34].

除了直接调控DNA转录,相分离结构也参与调节mRNA稳定性和蛋白质翻译的过程.在人类细胞中研究比较广泛的相分离结构是应激颗粒和P-body,二者均为未翻译的mRNA储存场所,在mRNA降解及翻译抑制等过程中发挥作用[35].正常生理情况下,P-body通过分子之间多价互作将胞质中富余的、未被核糖体结合的mRNA募集到其相分离腔室中,并进一步抑制其翻译或者使之降解.而当在P-body溶解、相分离结构消失后,mRNA可重新进入细胞质,以便翻译成蛋白质.因此,P-body可作为细胞中mRNA和蛋白质的移动储存器,是蛋白翻译加工的缓冲地带[36].而在细胞受到胁迫的时候,翻译受阻的mRNA、胞质中的翻译起始因子,以及核质穿梭蛋白FUS、TDP-43等可被募集到应激颗粒液体腔室中,待胁迫信号消失以后,应激颗粒解聚,蛋白和mRNA重新恢复功能[37].

相分离甚至参与细胞中基因表达的空间调控.一个典型的例子是神经细胞轴突中用于长距离运输mRNA的RNA转运颗粒.它们通过相分离结构将mRNA沿轴突运输到远端,当到达预定部位后,可重新释放mRNA用于翻译.肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)相关蛋白ANXA11的N-端LCR结构域可发生LLPS,进入RNA转运颗粒液体腔室中,同时其C端膜结合域可与溶酶体膜结合.ANXA11通过这样的方式使得RNA转运颗粒与溶酶体相连,从而使得RNA转运颗粒可通过“搭便车”的方式,随溶酶体在细胞微管上运动,从而长距离转运mRNA[38].

3.2 相分离和细胞信号转导 细胞信号转导往往涉及到多个配体、受体和通路上多个蛋白之间的互作.研究发现,许多涉及到膜受体信号转导的过程中都存在相分离的现象.除了Nephrin-Nck-N-WASP信号通路中膜上的相分离,T细胞受体被激活后,下游信号蛋白会发生相分离形成膜上液体样簇来介导信号转导[15].此外,信号转导中间分子也会通过发生相分离来发挥作用.如细胞质的DNA与其感受器环状GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)结合后,强烈地诱导cGAS发生LLPS并激活cGAS酶活性,最终促进了环状GAMP的产生和先天免疫信号转导[39].有意思的是,2018年Ma等[40]发现,RNA结合蛋白TIS11B形成的相分离结构TIS 颗粒与糙面内质网组成一种亚细胞区室,被称为TIGER域.TIS 颗粒富含具长3’UTR的膜受体CD47的mRNA (CD47-LU mRNA),可通过其3’UTR招募信号分子SET蛋白.TIGER 域可促进CD47-LU mRNA翻译产生的CD47与SET蛋白相互作用,从而使CD47更高效地定位到细胞膜上.

3.3 相分离的其他功能 近年来研究发现,相分离结构在蛋白质质量控制中发挥重要作用.核仁可通过相分离募集因胁迫信号错误折叠的蛋白,防止它们自发聚集形成核内包涵体而对细胞造成毒性[41].类似地,应激条件下,蛋白酶体可依赖于泛素化修饰蛋白形成相分离液滴,促进蛋白酶体底物蛋白的降解[42].

除了在细胞内发现的相分离现象,研究者也在细胞外基质以及细胞紧密连接处也发现了蛋白相分离结构.ZO蛋白会发生LLPS并与细胞膜结合形成区室化结构,通过该结构ZO蛋白可选择性募集紧密连接相关的蛋白,从而介导细胞之间的紧密连接[43].在细胞外基质中,介导细胞连接和信号转导的细胞外凝集素蛋白Gatectin3可通过NTD中的芳香族残基驱动LLSP发生,局部提高Gatectin3的浓度,促进Gatectin3的凝集功能[44].这些结果提示,相分离结构可参与到介导细胞之间的紧密连接以及细胞黏附.

4 LLPS与疾病

蛋白质或者核酸也影响着相分离结构的结合状态和理化性质,大分子之间的多价结合状态发生异常改变会造成相分离结构的解聚或者流动性降低形成不可溶颗粒,破坏其正常生理功能,最终引起各种各样的疾病.

4.1 相分离失调和神经退行性疾病 目前,大量的LLPS失调相关的疾病研究都集中于神经退行性疾病领域.蛋白质的突变会造成大分子之间的相互作用结合状态发生改变,从而使得相分离液滴的物理化学性质发生改变,从动态程度较高的液态结构逐渐转变为半凝胶状甚至是固态[45].凝胶状态的相分离经常不可逆转,这也为阿尔兹海默症等神经退行性疾病中淀粉样纤维的形成,提供了全新的思路.已有大量实验证据表明,FUS、TDP-43和hnRNPA1等应激颗粒相关组分的突变会引起应激颗粒凝胶化并进一步固化形成不可溶颗粒(包涵体),促进细胞中产生纤维样蛋白沉淀,与肌萎缩性侧索硬化、额颞叶痴呆(frontotemportal dementia,FTD)和包涵体肌病等神经退行性疾病的发生有关[46].C9orf72的内含子移码突变产生富含精氨酸的重复二肽结构会促进应激颗粒组分蛋白中PLD结构域之间的相互作用,破坏应激颗粒的液相流动性或者黏性,引起细胞毒性,最终引起ALS[47,48].在线虫模型以及ALS病人脑组织中都能观察到松散的网状纤维结构,与体外重组含ALS相关突变的FUS蛋白形成的结构相类似[49].亦有研究发现,TDP-43的ALS相关突变会破坏胞质中RNA 颗粒的长距离运输过程,从而引起疾病[50].在几乎所有的神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病、帕金森病、FTD和亨廷顿病,都发现了含有错误折叠聚集或碎片的TDP-43包涵体[51].最近在Wang等[52]发表的研究工作表明,引起后天神经发育障碍雷特综合症的x连锁基因突变会造成其编码蛋白MeCP2错误定位,引起相分离发生的能力削弱,破坏异染色质结构引起疾病.

4.2 相分离失调和其他疾病 相分离与皮肤屏障缺陷相关的疾病和肿瘤的发生也密切相关.研究表明哺乳动物表皮形成的过程中也会有相分离的现象发生,相分离现象失调会造成表皮发育不良,从而引起皮肤屏障缺陷相关的疾病[53].癌症是威胁人类生命健康的主要疾病之一,人们发现在癌症的发生发展中也有相分离失调的现象.尤因氏肉瘤中发现相关基因的易位破坏了原有蛋白的LCD结构域,从而造成新产生的融合蛋白与核酸结合能力的下降,引起下游蛋白功能的异常[54].前列腺癌中常见的SPOP蛋白突变会导致SPOP和底物共定位和液相分离,使得底物不能被泛素化降解,造成癌蛋白的累积,引起癌症发生[55].

5 结论

LLPS结构的发现为研究生物大分子的“高维”结构和功能提供了一个新视点.随着研究的深入,人们也越来越清晰地认识到细胞中LLPS结构是一种具有重要生物学功能的独特结构,也认识到其复杂性,因而LLPS结构也成为近年来生命科学研究的热点.

然而目前相分离的研究主要依赖于体外重构相分离体系和细胞内成像实验,无法在体内确认相分离体系的精确特征.通过在细胞内过表达蛋白,观察到形成较大的,球状的结构,通常无法准确反映细胞内的蛋白生理浓度水平下的真实情况.由于显微技术的限制和精确衡量标准的缺失,人们也无法准确地绘制活细胞内蛋白相变化的动态过程[2].虽然通过人工添加的蛋白标签或者光诱导相分离技术可观察细胞内蛋白的动态变化[56,57],但是这种方式容易引入额外的结合价位干扰.因此,需要开发更多更准确地实验技术对相分离这一现象进行研究.

另外,目前有关LLPS与疾病的研究大多集中在神经退行性疾病方面,相分离在其他疾病尤其是癌症发生发展中的功能仍是未知之迷.研究者发现在细胞中关键的信号通路(如TCR信号转导途径、cGAS免疫信号转导途径)中都存在相分离现象[15,39],而这些通路上蛋白的突变是促进癌症发生发展的关键,可推测相分离的失调与癌症发生发展之间有着密切的关系[58].因此,各种疾病和肿瘤发生发展中LLPS的作用与机制也是值得加强的方向.