精神分裂症患者外周血PI3K-AKT基因表达及与临床症状相关性分析

张 强 段艳文 杨翠红

精神分裂症(Schizophrenia)为一种患病率、复发率与致残率均较高的慢性精神障碍性疾病，患者社会功能受损，以思维、情感及行为等障碍与精神活动不协调为主要表现，即使采用最有效的抗精神病药物治疗，仍有25%～50%的患者存在精神病性症状[1]。关于精神分裂症的发病机制目前尚未明确，较多研究[2～4]均表明精神分裂症的发病中有多巴胺、去甲肾上腺素、Dysbindin等基因参与。磷酸肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)是多巴胺D2受体(DRD2)重要下游细胞内信号传导通路，与精神分裂症发病中多巴胺、去甲肾上腺素等基因下游信号的传导有密切关系，亦是抗精神病药物及情绪稳定剂起效的稳定性靶点，其中PI3K信号通路障碍与精神分裂症发病机制相关，如精神分裂症患者家族基因关联研究[5]报道PI3KCB基因多态性与精神分裂症发病风险增高相关。本研究主要分析不同病情精神分裂症患者PI3K-AKT基因表达与临床症状的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2017年11月～2018年12月聊城市第四人民医院收治的90例精神分裂症患者作为研究对象。入组标准：(1)符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版修订版(DSM-IV-TR)关于精神分裂症的诊断标准[6]，即至少满足以下两项症状标准：①有反复性的言语性幻听；②明显的思维松弛、思维破裂、言语不连贯或者思维贫乏、思维内容贫乏；③思维被插入，感觉有一种思维突然在自己思维里出现；④思维被洞悉、被控制；⑤有原发性妄想，包括被害妄想或被盗、被洞悉情况；⑥思维逻辑倒错、病理性象征性思维或语词新作，将一些较普通的言语赋予特别含义，情感倒错、紧张、愚蠢行为、明显的意志减退、缺乏；(2)阳性和阴性综合征量表(PANSS)得分≥90分；(3)无药物滥用记录，且自愿参与本次研究，患者及法定监护人签署知情同意相关文件。排除标准：有电休克治疗史或烟酒等物质依赖史、药物滥用史；DSM-Ⅳ-TR诊断为其他精神性疾病；合并免疫性疾病或近3个月内有重大手术史、输血史；合并急慢性感染、炎症、服用免疫抑制剂者。其中急性精神分裂症(呈急性起病，且主要表现为幻觉、妄想、思维紊乱、多疑、有牵连观念及被害妄想，思维被大声说出来)患者50例，纳入急性组，慢性精神分裂症(长期服药，DSM-Ⅳ-TR残留精神分裂症亚型的精神分裂症亚型或残余精神分裂症亚型，主要表现为情感淡漠、意志缺乏、动作迟缓及社会退缩)患者40例，纳入慢性组，慢性组总病程>2年，入组时服用氯氮平至少6个月，达治疗剂量。另选择同期于体检中心体检的健康志愿者30名为对照组，均无药物滥用史、精神疾病、免疫性疾病或重大手术史、神经心理疾病史。急性组中男26例，女24例，平均年龄(33.78±3.59)岁；慢性组中男23例，女17例，平均年龄(50.14±5.23)岁；对照组中男15名，女15名，平均年龄(28.97±3.06)岁。三组性别构成比较差异无统计学意义(P>0.05)，而年龄比较差异有统计学意义(F=274.164，P<0.05)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 均于清晨抽取空腹静脉血2 ml，其中急性组血液采集需在药物治疗前完成，全血采集后3 h内完成总RNA提取，后冻存在-80℃冰箱中。

1.2.2 临床症状评估 PANSS及个体与社会表现量表(PSP)评估：在采血的当天8：30～10：30 am，由1名固定主治医师在询问患者病史或进行精神检查后行单盲法评定。以PANSS[7]评估其阳性与阴性症状，PANSS量表共含30项及3个补充项目评定攻击危险性，分为阳性症状、阴性症状、一般精神病理学3个分量表，得分越高，症状越严重；应用PSP评估其社会功能，PSP量表含4个领域，总分0～100分，得分越高社会功能越低下。

1.2.3 PI3K-AKT基因表达水平测定 (1)提取总RNA：采用吸附柱法试剂盒将总RNA提取出，应用紫外分光光度法对RNA的浓度及纯度进行测定，采用1.5%的琼脂糖凝胶在180 mV下电泳5 min，对RNA完整性进行判定。(2)逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)与相对定量评估：将400 ng的总RNA作为转录模板，采用逆转录试剂盒及Oligo d(T)作为引物合成cDNA，反应混合物放置于42 ℃的水浴中，反应20 min后在95 ℃的水浴中放置3 min以使反应终止，后将反应所得到的生成物放置于-80 ℃保存待测。采用QuantiFast Probe Assays(购自QiagenCo,Germany)与QuantiFast Probe PCR Kit(购自Qiagen Co,Germany)、ABI Prism 7500型PCR仪(购自美国ABI公司)予以实时qRT-PCR。探针测定包括AKT1引物、Hs AKT1P QF1 QuantiFast与PI3KCB引物、Hs PI3KCB QF1 QuantiFast，应用GADPH引物及探针为内部对照，PCR反应体系的总体积25 μl，反应条件为40个循环，首先94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，均平行测定3次后获取平均Ct值，按Ct值对斜率及截距进行计算，并绘制标准曲线。采用双标准曲线法对PI3KCB mRNA及AKT1 mRNA表达水平进行分析。分析各组PI3KCB mRNA及AKT1 mRNA水平相关性，同时分析精神分裂症患者中PI3KCB mRNA、AKT1 mRNA的表达水平和PANSS评分及PSP评分相关性。

2 结果

2.1 三组外周血PI3KCB mRNA与AKT1 mRNA表达水平分析 三组间PI3KCB mRNA与AKT1 mRNA表达水平比较差异均存在统计学意义(P<0.05)。进一步两两比较发现，急性组PI3KCB mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)，急性组AKT1 mRNA表达水平高于慢性组、对照组(P<0.05)。见表1。

表1 三组外周血PI3KCB mRNA与AKT1 mRNA表达水平分析

2.2 急性组、慢性组PANSS、PSP评分比较 急性组、慢性组的PANSS、PSP评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 急性组、慢性组PANSS、PSP评分比较

2.3 三组PI3KCB mRNA与AKT1 mRNA表达水平相关性分析 Pearson相关性分析显示，急性组、对照组中PI3KCB mRNA与AKT1 mRNA表达水平无相关性(r1=0.165，P1>0.05;r2=0.137，P2>0.05)，而慢性组中PI3KCB mRNA与AKT1 mRNA表达水平呈正相关(r=0.389，P<0.05)。

2.4 急性组、慢性组PI3K-AKT基因表达水平与临床症状的相关性分析 Spearman相关性分析显示，急性组、慢性组PI3KCB mRNA、AKT1 mRNA表达水平与PANSS、PSP评分均无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 急性组、慢性组PI3K-AKT基因表达水平与临床症状的相关性分析

3 讨论

精神分裂症为一种病因未明、反复发作、致残率高的重性精神疾病，患者以幻觉、妄想等阳性症状，情感淡漠等阴性症状，学习、记忆功能受损等认知功能障碍为主要特征，至今尚未发现可靠的客观生物学指标对本病进行辅助诊疗[8]。PI3K-AKT信号通路为细胞内调控细胞转录、翻译、代谢、增殖、迁移与生存的主要信号通路，在许多病理生理活动中起着关键作用，尤其在神经保护方面举足轻重，其整体效应为提高细胞复制与存活能力，且减弱生长阻滞与细胞凋亡，其过度激活与肿瘤发展、侵袭、预后差及耐受癌症治疗等有关[9，10]。有研究发现，PI3K-AKT信号通路在皮质发育畸形[11]、阿尔茨海默病[12]中起着重要作用，但目前关于PI3K-AKT信号通路在精神分裂症病理生理过程中的作用研究较少。

本研究显示，急性组PI3KCB mRNA表达水平低于对照组，这与刘亮等[13]的研究结果相似，表明急性精神分裂症患者中PI3KCB mRNA呈低表达，PI3K参与精神分裂症发病，可促进AKT同细胞膜结合，后使AKT继续被磷酸化而激活，而AKT又参与细胞凋亡、细胞增殖等，在转录及细胞迁移中起着关键作用，是精神分裂症可靠的生物标志物，因而PI3K-AKT信号通路障碍可能同精神分裂症发病有密切关系[14]。本研究慢性组与对照组的PI3KCB mRNA表达水平比较差异无统计学意义，说明长期采用氯氮平抗精神病药物治疗将PI3K控制到了与对照组相当的水平。本研究也显示，急性组AKT1 mRNA表达水平高于慢性组及对照组，说明AKT与PI3K同时参与精神分裂症发病。PI3K通常在生理状态下被细胞外信号激活，如生长因子、细胞因子与激素等可能使其激活，之后的信号级联反应主要由AKT、核糖体蛋白S6激酶及糖皮质激素调节的蛋白激酶等活化来调节[15]。AKT(包括AKT1、AKT2各亚型)是PI3K主要的下游效应分子，为胰岛素受体细胞内信号的关键成分，参与不同细胞过程的调节[16，17]。在精神分裂症患者发病过程中，PI3K-AKT是DRD2重要的下游细胞内信号通路，参与多项精神分裂症相关基因如多巴胺、5-羟色胺等的下游信号传导，也是抗精神病药物与情绪稳定剂作用靶点；DRD2受体也能将PI3K-AKT信号通路活性进行下调，继而发挥调节细胞增殖、生长与分化、代谢等作用，最终导致精神分裂症。本研究也发现，慢性组与对照组的AKT1 mRNA表达水平比较差异无统计学意义，这可能是因为慢性精神分裂症患者已接受氯氮平(使用的药物剂量已达到治疗量)单药治疗≥6个月，在予以氯氮平治疗后AKT水平已调节到与对照组水平持平的状态。此外本研究中急性组、对照组中PI3KCB mRNA与AKT1 mRNA表达水平无相关性，而慢性组中PI3KCB mRNA与AKT1 mRNA表达水平呈正相关，这与顾曙光等[18]的研究结果相似，表明长期采用氯氮平治疗的慢性精神分裂症患者AKT1表达可能已发生改变，继而使PI3KCB与AKT1的mRNA表达相关性发生了变化[19]。

本研究也显示急性组、慢性组的PANSS、PSP评分比较差异无统计学意义，而PI3KCB mRNA、AKT1 mRNA表达水平与PANSS、PSP评分无相关性，说明PI3K-AKT信号通路有参与到精神分裂症发病中，尤其在急性发病的精神分裂症患者中较明显，但抗精神病药物会调节PI3KCB mRNA及AKT1 mRNA的基因表达水平，并改善患者的精神症状，因而PI3K-AKT信号通路表达水平仅可作为精神分裂症患者状态指标而非素质指标，这与既往王巍等[20]的研究结论一致。

当然本研究也存在有研究样本量小、未限制入组精神分裂症患者疾病表型等局限性，因此后期有必要进一步扩大样本量、从基因表达水平入手深入分析PI3K-AKT通路在精神分裂症患者中作用机制。同时本次选取的急、慢性精神分裂症患者，其年龄比较差异存在统计学意义(P<0.05)，这是否对研究结果有影响未知，后期需进一步探讨。

综上所述，不同病情精神分裂症患者PI3K-AKT信号通路基因表达水平存在差异，其中急性精神分裂症与慢性精神分裂症的AKT mRNA表达水平差异较明显，但PI3K mRNA、AKT mRNA表达水平与临床症状无相关性，长期应用氯氮平行抗精神病治疗可能影响PI3K-AKT基因的表达。