基于网络药理学研究丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病的分子机制

庞静雯，王丹慧，徐梅月，张艳春，2，张祖志

(1. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2. 中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

糖尿病归属于中医学“消渴”范畴，其病机为阴液亏损、燥热偏胜[1]，临床症状有多饮、多食、尿甜、体瘦等。白虎加人参汤[2]、葛根芩连汤等可以治疗糖尿病。白虎加人参汤能够用于津气两伤、身热而渴、出汗、恶寒、烦渴、多尿等症状的治疗[3]。葛根芩连汤可以生津养液，改善消渴症状[4]。

丹蛭降糖胶囊是安徽中医药大学第一附属医院方朝晖研制的中药制剂，由太子参、水蛭、牡丹皮、泽泻、生地黄、菟丝子组成，临床用于改善胰岛素抵抗，预防和治疗糖尿病及并发症[5]。研究表明：太子参多糖具有很好的缓解胰岛素抵抗的作用[6]；生地黄中萜类和多糖都具有降低血糖的功效[7-8]；丹皮酚具有抗炎、降低血糖等功效；牡丹皮和菟丝子中含有槲皮素，具有抗氧化应激和抗炎的作用；泽泻中萜类提取物能够发挥治疗糖尿病的作用[9]；水蛭的主要成分水蛭素具有凝血的功能[10]，可以发挥治疗糖尿病血管病变作用[11-12]。现有报道指出，丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病及其并发症的作用机制可能与调节VEGF/Akt/eNOS信号通路[13]，激活TGF-β1/Smad3信号通路[14]，调控mTOR/S6K1信号通路介导的细胞自噬[15]等有关。

本研究采用网络药理学方法，研究丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病的分子机制，为该方的临床药理学研究提供理论基础。

1 方法

1.1 药物活性成分及作用靶点的筛选 利用中药系统药理学平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)和中国中药整合数据库(traditional Chinese medicine systems pharmacology database andanalysis platform，TCMID)分别检索太子参、泽泻、牡丹皮、菟丝子、水蛭、生地黄的化学成分。在TCMSP数据库中，根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，药物相似性(drug likeness，DL)≥0.18为筛选条件[1]获得主要有效活性成分化合物。同时，在TCMID中，获取水蛭、生地黄对应活性成分及SMILE码。再利用蛋白质数据库(Uniprot数据库)和Swiss Targets Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)获取活性成分的靶蛋白基因信息。

1.2 糖尿病相关靶点的获取 以“diabetes”为关键词，在人类基因库(GeneCards)中检索获得有关糖尿病的靶标基因。

1.3 活性成分-糖尿病靶标网络的构建 为明确“丹蛭降糖胶囊”与糖尿病潜在靶点间的相互作用，将丹蛭降糖胶囊活性成分对应的靶点与糖尿病靶标基因导入Venny网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，绘制交集基因的韦恩图。运用Cytoscape 3.7.2软件，通过Tools模块内“Network Analyzer”模块进行分析，构建其活性成分-糖尿病靶标网络模型。

1.4 蛋白相互作用网络(protein-protein interaction，PPI)的构建 利用蛋白互作平台数据库(STRING)分析筛选得到的疾病-药物成分共同靶蛋白信息，获得相互作用关系，导入Cytoscape 3.7.2分析并绘制PPI网络图。

1.5 靶点的通路和基因本体(gene ontology，GO)分析 借助ClusterProfiler R软件，对丹蛭降糖胶囊的活性成分作用靶点进行GO分析，以了解靶点主要的作用过程；再进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的代谢通路富集分析，以了解靶点在通路中分布情况。获取丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病涉及的关键生物学过程及关键信号通路。

2 结果

2.1 丹蛭降糖胶囊活性成分筛选 从TCMSP和Swiss Target Prediction数据库中，共获得丹蛭降糖胶囊活性化合物48个，其中菟丝子12个，泽泻10个，牡丹皮11个，太子参8个，水蛭3个，生地黄8个。见表1。

2.2 糖尿病靶点获取与PPI网络构建 借助GeneCards检索“diabetes”，共获得564个糖尿病候选靶点。

2.3 交集靶标筛选结果 绘制244个活性化合物对应靶点与糖尿病对应的564个靶点的韦恩图，最终获取共有基因靶点77个，共得到对应丹蛭降糖胶囊的活性成分25个。

表1 丹蛭降糖胶囊活性成分表

续表1

2.4 活性成分-糖尿病靶标网络构建及网络分析 利用Cytoscape 3.7.2软件，将丹蛭降糖胶囊的活性成分与糖尿病作用靶标一一映射，构建网络模型。网络图中，包含节点108个(靶基因数量77个，活性成分数量25个，药物数量6个，边351条)。利用“Network Analyzer”功能对网络图中相关性进行分析，Degree最高的是槲皮素(quercetin)，其次是山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、异鼠李素(isorhamnetin)、刺槐素(acacetin)等，Degree越高，表示化合物与糖尿病的相关性越大，提示以上化合物在影响糖尿病中发挥重要作用。见表2。

表2 丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病的关键化合物信息

2.5 PPI网络构建及关键靶点筛选结果 将预测的77个作用靶点导入STRING获取蛋白互作网络关系，设置最低相互作用评分为中等置信度0.4，删除孤立点IER3IP，得到76个预测靶标。再次借助Cytoscape 3.7.2软件制作PPI网络图(图1)，PPI网络图包括76个节点，2 258条边，平均Degree值为29.7。Degree数值越大，节点大小越大，对应重要程度越高。取Degree值前30位作为核心基因，根据Degree值排序，排名前列的分别是白细胞介素-6(IL-6)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等，制作柱形图(图2)。

2.6 GO功能分析结果 对76个共有靶点进行GO功能分析，共获得生物学过程1 702个，主要涉及对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、小分子代谢过程的调控、对营养水平的反应、氧含量反应、缺氧反应；细胞组成27个，主要涉及膜筏、膜微区、膜区等；分子功能87个，主要涉及细胞因子受体结合、受体配体活性、细胞因子活性、磷酸酶结合、类固醇结合、丝氨酸水解酶活性等。根据P大小，利用R语言绘制气泡图，列举排在前列的条目，见图3。

2.7 KEGG富集通路分析结果 KEGG通路富集分析发现，76个交集基因富集在149条通路上，按照显著性排序，取排名前20的富集条目绘制条形图(图4)。

结果表明，化合物作用的靶点主要涉及糖尿病并发症中晚期糖基化终末产物(AGE)-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、流体切应力与动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、Toll样受体信号通路、甲型流感等。

图1 PPI网络图

图2 丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病的核心基因

3 讨论

本研究利用网络药理学的技术和方法，构建了靶点和疾病的网络模型并进行通路富集分析，系统探索丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病的可能活性成分及潜在分子机制。

3.1 可能关键成分的药理作用 本研究表明，丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病的关键成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素、β-谷甾醇等。已有研究证实：槲皮素能够提高成纤维细胞生长因子21(FGF21)水平，从而激活下游关键激酶腺苷酸依赖的蛋白激酶(AMPK)，从而改善胰岛素抵抗状态[16]。槲皮素还可以抑制p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)，降低下游NF-κB表达，从而减少IL-6、TNF-α等炎症因子分泌，发挥抗炎的作用[17]。木犀草素可以激活脂肪细胞中AMPK和PPARγ，从而提高胰岛素敏感性[18]。木犀草素可以减少小肠吸收碳水化合物，降低餐后血糖。木樨草素可以降低糖尿病期间Wnt/β-catenin信号通路的抑制，达到改善胰岛素抵抗及糖脂代谢紊乱的目的[19-20]。β-谷甾醇的功能包括抗炎、抗肿瘤、中枢神经调节等，但是未见糖尿病治疗作用报道。

综上，推测槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇为丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病的关键化合物，而刺槐素可作为潜在化合物进行进一步研究。此外，已有研究指出，丹皮酚、太子参多糖、生地黄多糖、泽泻中萜类均具有降低血糖的作用，但是在该方中，是否为降低血糖的主要成分有待进一步实验证实。

注：圆点越大代表富集基因数目越多，颜色越红代表P值越小

图4 KEGG富集分析柱状图

3.2 潜在作用机制分析 PPI网络图和GO功能分析展示了丹蛭降糖胶囊与糖尿病关系密切的靶标。丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病的协同作用，表现在调节炎症细胞因子分泌，激活血管新生的相关靶点[血管内皮生长因子A(VEGFA)，与胰岛素信号通路相关的GAPDH、Akt1]，抑制与氧化应激有关的原癌基因JUN、丝裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、MAPK14等。KEGG富集信号通路提示该复方治疗糖尿病的主要潜在的信号通路。例如，AGE-RAGE通路能够导致胰岛细胞受损和凋亡[21-22]，造成胰岛素的分泌下降，同时该通路还与糖尿病的慢性并发症有关。AGEs与受体结合后，下调多条信号通路，如PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT，激活核转录因子NF-κB[23]，进而调节多种炎症反应因子如TNF-α、IL-6、IL-8引起糖尿病相关病变。同时，前期研究证实：丹蛭降糖胶囊可以抑制高糖诱导TLR4/MyD88/NF-κB信号通路过度表达[24]；抑制mTOR/S6K1信号通路，进而提高足细胞的自噬活性[15]；也可以激活糖尿病血管病变状态下被抑制的VEGF/Akt/eNOS及Ang/Tie2信号通路，促进血管基底膜的解离，为血管新生的启动做准备等[25-26]。这些实验结果与网络虚拟筛选结果基本吻合。

综上，丹蛭降糖胶囊中发挥作用的主要成分包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素、刺槐素、β-谷甾醇等。综合文献，未见刺槐素直接治疗糖尿病的相关报道，但有研究[27]表明剌槐素能通过降低NF-κB通路的活化水平，抑制TNF-α诱导MCP-1及其mRNA分泌从而发挥抗炎作用。由此推断刺槐素可能通过抗炎作用，发挥对器官的保护作用。

水蛭是本复方中较为特殊的药材，但是本研究结果中，重要化学成分中未见与水蛭相关的化学成分。这可能是因为水蛭素具有活血化瘀的功效，对糖尿病并发的血管内皮损伤具有修复作用。但是由于在网络药理学分析时，以糖尿病的发病机制为出发点，所以筛选结果中，水蛭素不作为发挥活性的关键化合物。由此推测水蛭素作用机制可能与血小板活化信号通路、Ras等信号通路有关，发挥协同效应，以调节伤口愈合、血液凝固、葡萄糖稳态等生物过程，从而预防高血糖对肝脏造成的损伤。

由于网络药理学仍存在局限性，数据库信息有限，后期仍要通过实验研究进行系统的药理学验证。本次研究为今后深入研究其机制提供了理论基础。