牙龈卟啉单胞菌靶向细胞膜运输的研究进展

孙玲云，原 翔，刘怡文，孔金玉，兰子君，孙 蔚，张秀森，郭艺博，高社干

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，中国是世界上食管癌高发地区之一，其死亡率名列中国十大恶性肿瘤的第四位[1]。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)与食管鳞状细胞癌的发生和发展有关，被认为是食管鳞癌的高危因素[2]。有研究表明，Pg可利用膜运输途径进入细胞，从而实现其在宿主细胞内的长期存活[3]。

细胞膜运输途径包括一系列高度动态的内吞作用、分泌和自噬途径，这些过程需要不同SNAREs、GTPases以及肌动蛋白细胞骨架的联合作用，它们对于维持细胞器的稳态和定位以及确保细胞内运输至关重要。细胞内病原体，比如细菌和病毒，必须穿过宿主细胞膜才能进入细胞，为了避免被溶酶体降解，它们隐藏在固有免疫传感器中，会建立一个安全的生态位以便于自身的生存和复制，但最终为了离开宿主细胞，不得不再次穿过细胞膜。因此，这些病原体已经进化出不同的方式来操纵和利用宿主细胞膜运输途径。实际上，最近对200株革兰氏阴性菌分泌的独立因子进行的筛选显示，这些独立因子中有30%以上分泌到宿主细胞膜上[4]。在它们穿越细胞膜的整个过程中，不同的病原体使用不同的策略，这取决于他们对生存和复制的要求以及他们与宿主共同进化的方式。例如，某些细菌驻留并劫持内吞途径以供复制，而其他细菌则避免内吞途径，并在其他地方建立其细胞内生态位[5]。除了使用宿主细胞膜或膜区室，病毒可以利用宿主细胞机制(比如翻译机制)，供自己复制[6]。然而，操纵宿主细胞膜最关键的接触点在不同的病原体之间非常相似：细胞膜、肌动蛋白细胞骨架、内吞途径、分泌途径和自噬[5-7]。一些新技术，如全基因组CRISPR/Cas9筛选和Cryo-EM，有力地提升了对病原体与宿主细胞膜相互作用的认识。本文讨论细胞内细菌和病毒在靶向膜运输后利用细胞分泌和自噬途径方面的最新进展。

1 病原体操纵自噬途径

自噬途径可能类似于细胞内病原体最具威胁性的膜运输途径，因为它可以被宿主细胞用于吞噬和降解入侵者。因此，大多数病原体避免与吞噬体或自噬途径的成分融合。但是，某些病原体已经形成利用这种抗菌途径的策略。

Pg作为一种牙周致病菌，能够利用其引发的细胞自噬实现其在宿主细胞内的生存和增殖，从而逃避宿主的免疫监视。Pg的菌毛通过与整合素蛋白α5β1相结合实现其对细胞的黏附，是Pg内化于宿主细胞的初始步骤。研究表明，自噬抑制剂渥曼青霉素能显著减少牙龈上皮细胞中Pg的数目，表明自噬可能有助于胞内Pg的存活。

Pg已显示出可以刺激内皮细胞自噬并利用自噬途径发挥其优势。在人冠状动脉内皮细胞中，Pg位于自噬体中。细胞内摄取后，Pg从早期自噬体过渡到晚期自噬体，并阻止了自溶酶体的形成，通过延迟自噬体—溶酶体融合或重定向正常自噬运输。此外，由于观察到自噬小体标记物LC3-Ⅱ与Pg共定位，还发现Pg可刺激人主动脉内皮细胞中的自噬。Pg向自噬途径的运输似乎取决于宿主细胞类型。Pg通过颠覆宿主自噬途径的而存活，这是逃避先天免疫系统并持续存在于宿主体内的一种细菌策略[3]。

2 病原体抑制自噬途径

Pg在牙龈上皮细胞中可能存在3种运输途径，即自噬、溶酶体及再循环途径。吞噬细胞中溶酶体的成熟需要自噬蛋白LC3与黑素曲菌素(melanoregulin，MREG)相结合，因而MREG介导的LC3依赖性的降解途径是清除细菌的必要过程，Blasi等[8]在重度牙周炎患者的牙龈上皮细胞中观察到自噬蛋白LC3与黑素曲菌素的重新分布，二者呈现一定程度的共定位，而在轻度牙周炎及健康人群中分离的牙龈上皮细胞中则观察不到这一现象。定量分析显示健康人牙龈上皮细胞中的LC3Ⅱ水平高于牙周炎患者，同时牙周炎患者的MREG与Beclin水平降低至基线水平的50%，因而推测牙周炎患者牙龈上皮细胞中的Pg感染可能影响了MREG和(或)LC3的表达，抑制了正常的自噬过程，导致Pg在胞内的清除减少，从而引起慢性牙周炎。

嗜肺军团菌(Legionellapsneumophila,Lp) 是避免自噬的病原体之一，它使用几种细菌独立因子来关闭这条通路。独立因子RavZ具有半胱氨酸蛋白酶活性，不可逆转地切割磷脂酰乙醇胺和LC3之间的酰胺键，在此期间，LC3失去其末端甘氨酸[9]。因此，RavZ处理的LC3的细胞池不能再重新脂质化，导致对自噬的强烈抑制。目前尚不清楚RavZ是如何识别LC3的，以及它如何从自噬体膜中提取LC3。目前的模型是RavZ拥有一个C端PI3P结合结构域，它允许被募集到自噬体膜[10]，并且拥有一个N端LC3相互作用区域(LC3-interacting region,LIR)基序，该基序与自噬体表面上PE锚定的LC3结合[11]。另一种抑制自噬的机制是独立因子LPG1137对宿主SNARE蛋白Stx17的切割[12]。这导致PtIns3P在线粒体相关膜上的丢失，从而导致自噬的消失。为了使自己免受免疫细胞的自噬降解，细胞内细菌用其外膜蛋白OmpB保护自己不被自噬机制识别[13]。OmpB既在细菌周围形成保护层，又阻止其他细菌外膜蛋白的泛素化，从而使细菌逃避自噬受体的识别。在对肠道沙门氏菌、血清伤寒沙门氏菌逃避自噬的研究中发现，液泡型H+转运(V)-ATP酶是这种抗菌宿主防御途径中的一种新的参与者[14-15]。研究表明，鼠伤寒沙门氏菌独立因子SopF，是维持含沙门氏菌液泡所需的一种磷酸肌醇结合蛋白[16]，ADP-核糖核酸是v-ATP酶的一个亚基，它阻止招募ATG16L1到鼠伤寒沙门氏菌，并阻止伤寒杆菌被自噬清除[14]。

3 病原体破坏自噬途径

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)产生致孔毒素李斯特菌溶蛋白O(listeriolysin O，LLO)，它是感染周期中不同步骤的关键毒力因子。最近研究LLO的细胞内功能时，发现了一种新的线粒体吞噬降解受体[17]。LLO诱导Nod样受体X1(Nod-like receptor X1，NLRX1)的寡聚，后者暴露了NLRX1上的LIR基序，从而促进其与LC3的结合和诱导线粒体吞噬。通过减少线粒体活性氧的产生，对单核细胞增生症有保护作用。黄病毒为了其自身的复制，劫持了选择性自噬途径。病毒蛋白酶NS3切割ERphagy受体FAM134B，从而抑制ERphagy，促进病毒的产生[18]。在脂滴上，DENV蛋白NS4A与宿主蛋白AUP1结合。这种相互作用激活了AUP1的乙酰转移酶活性，从而促进脂肪吞噬以支持病毒颗粒的产生[19]。肠道病毒D68(EV-D68)为了自身的利益而主动诱导自噬。病毒复制需要自噬体SNARESNAP29和SNARESNAP47。但是，后来在感染期间，EV-D68蛋白酶C3通过切割SNAP29抑制自噬体—溶酶体融合[20]。自噬对人巨细胞病毒也具有上述的功能，并且似乎对病毒粒子的有效组装很重要[21-22]。最近的一份报告提示LC3同源物在病毒颗粒中的掺入，表明人类巨细胞病毒使用自噬膜来使自身成熟[22]。

4 病原体操纵分泌途径

分泌通路对宿主细胞的蛋白质、脂质的代谢和稳态起着至关重要的作用，因此是细胞内病原体的一个有吸引力的靶点。分泌途径中的膜转运是由ARF和Rab家族的特殊小GTPase、融合因子(例如可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体和膜形成蛋白)调节的，其中许多蛋白质被不同的细胞内病原体(包括细菌、病毒、寄生虫和真菌)靶向和/或利用。本文重点介绍最近发现的微生物利用宿主细胞分泌途径的一些例子。

4.1 嗜肺军团菌

Lp是分泌途径的主要操纵者之一。一旦进入宿主细胞，Lp通过其第 Ⅳ型分泌系统(T4SS)分泌前所未有数量(>330)的细菌效应蛋白[23]。许多这些独立因子通过翻译后修饰(post-translational modifications，PTMS)(如磷酸化、泛素化和甲基化)调节几种宿主蛋白的功能，并且导致了新PTMS(比如磷酸胆碱)或者新的生化机制(如非规范性蛋白泛素化)的产生[24-27]。一旦感染，一小部分独立因子阻止吞噬体与内小体/溶酶体系统的融合，而其他独立因子则有助于建立和重塑嗜肺军团菌的细胞内生态位、质膜衍生的含有军团菌的液泡(Legionella-containing vacuole，LCV)。这些独立因子与内质网衍生膜建立接触，并将LCV转化为嗜肺军团菌复制所需的内质网样细胞器。LCV似乎首先与管状内质网、内质网片段和内质网衍生的小泡相互作用，随后在其表面获得粗糙的内质网标记和核糖体，但事件的确切顺序尚不完全清楚[28-29]。

在这方面研究得最充分的宿主细胞因子是Rab1，它是一个参与内质网到高尔基体转运的小的GTP酶，在感染的不同阶段被多个Lp独立因子靶向并修饰，以将内质网衍生的囊泡募集到LCV[24-30]。先前的工作表明，Rab1的活性受独立因子介导的AMP化(和去AMP化)调节和磷酸胆碱(和去磷酸胆碱)的开关区域的调节[24-30]。除了AMPylating Rab1，独立因子DrrA可以招募外囊成分Sec5、Sec6和Sec15到LCV，介导其与内质网衍生囊泡的融合[31]。独立因子SETA可以葡聚糖化Rab1的开关结构域，以抑制其功能[32]。

Rab1是SidE效应家族(Sid Es)的一个靶标，Rab1在LCV形成中起着关键作用[25-33]。Sid Es揭示了蛋白质泛素化的一种新的、非规范的机制，是目前研究的主要焦点。与典型的泛素化(需要E1-配体、E2-连接酶、E3-配体和ATP的协同作用)相比，SidEs是“多合一”泛素连接酶，它首先用NAD衍生的ADP-核糖修饰泛素，并随后转移磷酰基(phosphoribosyl，PR)-泛素到目标蛋白的丝氨酸残基上[25-26，33-35]。Sid Es的活性被独立因子Sid J所抵消，该独立因子Sid J通过其单ADP核糖基转移酶结构域的多谷氨酸化抑制Sid Es[36-39]。最初，Sid Es主要针对小型GTPases，如RAB1、RAB6(高尔基体内运输)、RAB33b(高尔基体内运输)和RAB30(高尔基体基础设施的维护、自噬体的生物发生)[25]。随后的一项后续研究确定了内质—微管形成蛋白，即网状蛋白4(RTN4)是SIDE介导的PR泛素化的附加底物[28]。用PR-UBS修饰RTN4似乎诱导了它的寡聚，并诱导了在LCV周围具有突起的假小泡的形成。最近的两项独立研究最终表明，PR-Ub可以被独立因子DupA和DupB移除，并使用互补的方法确定了数百个潜在的SidEs靶标[29-40]。其中的靶点是与ER重塑和ER-phagy有关的蛋白质(如LNP1、RTN1、RTN3、FAM134A-C、SEC62和TEX264)，表明这些过程对于LCV生物发生具有重要作用。

Sid Es的活性导致内质网片段化和修饰的内质网蛋白在LCV周围积累，这表明内质网片段化可能是Lp将内质网膜招募到LCV的另一种机制[29-40]。根据这些发现，大的、具有内质网整形功能的、在内质网驻留的GTPaseatlastin3(ATL3)[41]，可以促进管状内质网招募LCV，并介导内质网衍生膜在LCV周围的同型融合[42]。在进行的全基因组宿主细胞CRISPR筛选中发现RAB10和RABIF是将管状内质网招募到LCV所需的附加的宿主细胞因子[43]。English AR等发现由RabIF稳定的Rab10被Lp独立因子SidC/SDCA招募到LCV，并被尚未确定的独立因子泛素化。敲除RAB10和RABIF抑制了RTN4与LCV的共定位。RAB10能诱导囊泡状、动态内质网结构域的内质网小管的生长[44]。这些结构是否与先前在LCV周围观察到的RTN4阳性假囊泡相同尚待确定[28]。因此，LCV似乎通过几种独立的机制—包括通过修饰小的GTPase和ER片段INDU从ERES中招募内质网衍生的囊泡、由SIDE介导的PR泛素化的ER形成蛋白。因此，LCV似乎通过几种独立的机制获得内质网膜，包括通过修饰小的GTPase和ER片段、从ERES中招募内质网衍生的囊泡、由SidE介导的内质网形成蛋白的PR泛素化。

4.2 黄病毒

黄病毒属的成员，包括登革热病毒(DengueVirus，DENV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、西尼罗河病毒(WestNilevirus，WNV)和黄热病病毒，与分泌途径，特别是与内质网有密切的联系[45]。这些病毒的基因组由正链RNA([+]RNA)组成，主要模仿宿主细胞mRNA。该RNA在宿主细胞核糖体上以帽依赖的方式翻译[46]，并在粗糙的内质网膜上合成单个多肽，然后将其切割成3种结构蛋白(structural proteins，SPs)和7种非结构蛋白(nonstructural protein，NSPs)，其中跨膜多通道蛋白，由病毒和宿主蛋白酶组成[45]。

最近的高通量筛选显示了fom9的核心作用。用于病毒复制或成熟的poiu3rER宿主细胞蛋白或蛋白质复合物，如转运蛋白组分SEC61、寡核苷酸转移酶复合物或蛋白质复合物在内质网相关降解中溶解[47-49]。内质网膜复合物的组分为DENV和ZIKV复制的必需宿主细胞因子，并且促进必需病毒NSP、NS4A和NS4B的折叠和稳定性，这是它们有效的生物合成所必需的[50-52]。为了保护新形成的病毒颗粒和复制复合物免受宿主细胞胞浆和天然免疫检测的影响，NSP戏剧性地重塑了内质网，从而创建了一个由粗糙的内质网中内陷的囊泡包(vesicles packets，VPs)和光滑内质网中的卷积膜组成的互联网络[46]。靠近VP和宿主细胞线粒体的卷曲膜的功能尚不清楚，它们的形成似乎是细胞型特异性的，但有人认为，这些膜结构对病毒蛋白的成熟起着一定的作用，或者是脂质储存的部位[46]。相反，VP似乎是复制细胞器，其中病毒RNA被病毒复制复合物复制，然后新合成的(+)RNA转移到相对的内质网池中的出芽病毒体中。但是，这些膜结构是如何形成的，以及它们的生物发生需要哪些宿主细胞因子，目前尚不清楚。

最近的研究表明，与Lp相似，DENV和ZIKV利用内质网膜形成蛋白进行复制、细胞内运输和成熟[53-54]。Atlastins ATL2和ATL3两个内质网驻留的大GTPase介导ER小管的融合，似乎在VPs的形成和病毒的成熟中起着核心作用[53]。尽管ATL2参与了VP的生物发生，ATL3在病毒的运输和成熟中起着重要作用。这两种蛋白质的相互作用在感染上发生了巨大的变化[53]。例如，在感染过程中，ADP-核糖基化因子4(ARF4)与ATL3的结合增强，病毒组装和释放需要ARF4，并且需要ATL3来回收宿主细胞蛋白酶呋喃到高尔基体，在高尔基体里它切割病毒包膜蛋白PrM，这是病毒成熟的一个重要步骤。内质网小管蛋白和ERphagy受体RTN3，特别是其亚型RTN3.1A，被招募到复制细胞器并且促进病毒复制[54]。敲除RTN3.1A可导致VPs囊泡减少或伸长。

综上所述，为了在宿主细胞中生存，细胞内病原体制定了不同的策略来避免或颠覆宿主细胞膜的运输途径。膜运输途径的利用往往是通过修饰或裂解关键宿主细胞蛋白来实现的。诸如CRISPR/Cas9筛选之类的新型高通量技术，使得能够鉴定以前未探索的宿主细胞靶标。例如，最近的进展突显了参与ER重塑和ERphagy的蛋白质在发病机制中的新作用。因为对ERphagy的详细机制仍知之甚少，因此研究针对ERphagy的细胞内病原体可能会为阐明这一途径提供线索，并有助于识别其关键成分。如本文所述，病原体靶向和操纵了其他形式的选择性自噬，例如线粒体吞噬、脂肪吞噬和异种吞噬，因此一种新的线粒体吞噬受体被发现。因此，病原体是宝贵的细胞生物学工具，将继续帮助我们了解关键的细胞膜运输途径。

Pg在体外侵袭多种细胞，目前，Pg与细胞膜运输间关系的研究多集中于牙龈上皮细胞和血管内皮细胞，与食管上皮细胞膜之间是否也存在靶向关系及其中具体的分子机制研究较少，值得进一步研究，为食管疾病的干预治疗提供新的思路。