芦笋优系T2-32-6组培快繁技术

施建军，张旭娟，杨涵，施渭尧，柴伟国

(1.杭州佳惠农业开发有限公司，浙江 杭州 311228； 2.杭州市农业科学研究院 生物技术研究所，浙江 杭州 310024)

芦笋(AsparagusoffcinalisL.)，又名石刁柏，为天门冬科天门冬属多年生宿根草本植物，芦笋的嫩茎既可鲜食，也可加工制罐，营养价值非常丰富；其嫩茎质地鲜嫩、清新可口，对心脏病、高血压、癌症等有特殊疗效，具有很高的药用价值，因此是一种药食同源的蔬菜，素有“蔬菜之王”的美誉[1-2]。由于芦笋所具的保健功能和较高经济价值，使得芦笋产业得以迅速发展。利用组织培养技术进行芦笋优良品系的快繁生产，既可以培育大量的优质种苗，满足生产的需要，又可以缩短育种年限[3]。杭州佳惠农业开发有限公司自2006年开始从世界各地引进芦笋优质种质资源，开展种质材料的创制和新品种选育。T2-32-6是从Jersey Giant全雄品种中选育出的优系，其生长势旺，丰产性好，抗旱、抗病能力强。鳞芽休眠、浅春季出笋早熟，嫩茎粗细一致，头部鳞片抱合比较紧凑，在夏季高温条件下不易散头，适宜作为杂交亲本。为加快芦笋优系T2-32-6的扩繁，在参考前人研究的基础上，对增殖培养、诱导生根等组培技术进行研究，建立了该品系植株材料的高效离体繁殖技术。

1 材料与方法

1.1 材料

杭州佳惠农业开发有限公司提供的芦笋优系T2-32-6植株。

1.2 处理设计

1.2.1 外植体处理

选择健康、综合性状好的T2-32-6单株，摘取露出地面但茎尖尚未分枝的嫩茎，用体积分数2%洗洁精浸泡8～10 min，洗净后在流动的自来水中冲洗30～60 min，吸干水分。在超净工作台上，用75%乙醇处理2 min，0.1% HgCl2灭菌15 min，再用无菌水冲洗5～7次；然后用解剖刀小心切除与药液接触过的伤口部位，切成带芽小段接种到诱导增殖培养基上。

1.2.2 培养条件

培养基中的糖含量均为30 g·L-1，琼脂为7.5 g·L-1，pH值为5.8。培养室温度25 ℃，光照度2 000～3 000 lx，光周期为16 h光照/8 h黑暗。

1.2.3 不同部位外植体

外植体分别为嫩茎白色部分、嫩茎绿色部分、嫩茎顶端。设3个处理，每瓶接种6个茎段，每个处理12瓶。10 d后，观察记录污染株数，计算污染率。

1.2.4 诱导增殖培养

把筛选出的灭菌效果好、适于诱导增殖的茎段分别接种于MS+0.2 mg·L-1NAA、附加不同浓度6-BA激素的培养基上。6-BA设3个浓度：0.1、0.3、0.5 mg·L-1，共3个处理。每个处理4瓶，每瓶接种6个茎段，重复3次。40 d后，观察记录丛生芽萌发情况，统计丛芽萌发率。

1.2.5 生根培养

选取粗壮的丛芽，接种在1/2MS+0.05 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1KT，附加不同浓度的IBA和嘧啶醇的培养基上。IBA设2种浓度：0.5、1.0 mg·L-1；嘧啶醇设2种浓度：0.1、0.5 mg·L-1。共4个处理，每个处理接种4瓶，每瓶接种6个丛生芽，重复3次。40 d后，观察生根情况，统计生根率。

2 结果与分析

2.1 外植体不同部位的灭菌效果

从表1可知，嫩茎的绿色部分是较适宜的外植体材料，污染率为40.3%，明显低于嫩茎顶端和嫩茎白色部分。嫩茎顶端由于被鳞片包被，灭菌效果差，不适宜作为外植体材料。嫩茎白色部分为植株基部，易受土壤污染，同时组织老化不利于丛生芽诱导分化。

表1 外植体不同取样部位的灭菌效果

2.2 不同激素组合的诱导增殖效果

由图1结果可见，嫩茎绿色部分的茎段接种于含0.1、0.3、0.5 mg·L-16-BA的MS+0.2 mg·L-1NAA组合培养基上，0.3 mg·L-16-BA的组合培养基丛芽萌发率最高，达89.2%；含0.5 mg·L-16-BA的培养基次之，丛芽萌发率为74.2%；含0.1 mg·L-16-BA的培养基丛芽萌发率为70%。结果表明，适宜芦笋茎段诱导增殖丛芽的激素组合为MS+0.2 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-16-BA。采用最适诱导增殖配方，在1.2.2节规定的培养条件下，带芽嫩茎绿色部分的茎段经过1～2个继代周期后，形成无根丛芽组培苗，其基部逐渐膨大，形成鳞茎盘，利于诱导生根(图2)。

图1 不同激素组合培养基的诱导增殖效果

培养基配方为MS+0.2 mg·L-1 NAA+0.3 mg·L-1 6-BA。图2 优系T2-32-6诱导增殖效果

2.3 不同激素组合的生根效果

选取粗壮的丛芽进行生根试验，在1.2.2节的培养条件下，接种在1/2MS+0.05 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1KT、附加不同浓度的IBA和嘧啶醇的培养基上。IBA设2种浓度：0.5、1.0 mg·L-1；嘧啶醇设2种浓度：0.1、0.5 mg·L-1。培养室温度25 ℃，光照度2 000～3 000 lx，光周期为16 h光照/8 h黑暗。表2结果表明，不同激素组合的生根率从高到低依次为0.5 mg·L-1嘧啶醇、0.1 mg·L-1嘧啶醇、1 mg·L-1IBA、0.5 mg·L-1IBA。GA抑制剂嘧啶醇的加入可有效促进芦笋丛芽生根，含有0.5 mg·L-1嘧啶醇的组合生根率较高，可达80.6%；且植株生长健壮，根粗壮且长，肉质根上长出吸收根。培养基中添加嘧啶醇的生根效果明显优于添加IBA(图3)。

表2 不同激素组合的生根效果

生根培养基配方为1/2MS+0.05 mg·L-1 NAA+0.05 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1嘧啶醇。图3 优系T2-32-6组培苗生根试验

3 小结与讨论

植物不同部位组织细胞的排列顺序和活动能力不同，在离体培养中也会产生不同的生育状态。顶芽生长势较强，体现了植物顶端优势作用，利于芽的分化形成；而茎基部细胞较成熟，器官分化率低于顶芽外植体[4]。本试验结果表明，嫩茎顶端因节间短，且外有鳞片覆盖，难以灭菌彻底，易污染；而嫩茎基部茎段已为白色，纤维化程度高，其丛生芽分化率低。因此，芦笋优系T2-32-6嫩茎的绿色部分为最佳外植体材料，这部分外植体茎段节间已伸长，易灭菌处理，同时保持了较好的组织分化能力。诱导增殖丛芽以MS+0.2 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-16-BA培养基为宜，丛芽萌发率可达89.2%；且经过1～2个继代周期后，茎基部逐渐膨大，形成鳞茎盘，利于诱导生根。

芦笋是组培中较难生根的植物。本试验过程发现，诱导增殖和生根过程中，部分丛芽茎基部逐渐膨大，形成鳞茎盘，鳞茎盘上方萌生大量的鳞芽，而这类形成鳞茎盘的丛芽在生根培养时，鳞茎盘下方易生出肉质根，生根率较高。T2-32-6丛芽生根在1/2MS+0.05 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1嘧啶醇的培养基上生根率较高，生根率可达80.6%。嘧啶醇可抑制赤霉素合成酶的活性[5]，从而减少芦笋体内的赤霉素含量，因此，嘧啶醇在本试验中有明显的促进生根作用。