提取方法对青叶苎麻叶蛋白功能特性的影响

职士淇 王满生 叶凤凌 陈 龙 张晓婷邱浩楠 何 强 熊夏宇 董 怡

(1. 四川大学轻工科学与工程学院，四川 成都 610065; 2. 中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205; 3. 农业部麻类生物学与加工重点实验室，湖南 长沙 410205; 4. 中山市第一职业技术学校，广东 中山 528478)

随着世界人口的剧增和生活水平的不断提高，人类对蛋白质的需求量也越来越大，积极开发新的蛋白资源具有重要意义[1-2]。苎麻是中国传统的纤维作物，生长快、产量高，其叶片约占植株质量的40%，苎麻叶还可食用[3]。青叶苎麻(Boehmerianiveavar. tenacissima)是白叶苎麻(BoehmerianiveaL. Gaud.)的变种[4]。孙延炜等[5]研究发现，青叶苎麻嫩茎叶粗蛋白含量比白叶苎麻的高3.75%，而粗纤维比白叶苎麻的低9.57%；其氨基酸含量较丰富，总氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分别较白叶苎麻的高20.71%，19.41%，且EAA/TAA为41%>40%，EAA/NEAA为69%>60%，被认为是优质植物蛋白源。此外，由于青叶苎麻叶片没有白色绒毛，极易被高速刀片打碎而过筛，粉碎机的生产性能和度电产量也大大提高[6]。

超声波辅助提取法由于操作简捷、提取效率高、能维持提取物原有结构和活性等优点，已被广泛用于辅助植物叶蛋白质的提取工艺研究，如桑树叶蛋白的提取率达14%左右[7]；青豆蛋白的最佳提取率达42%左右[8]；辣木蛋白的最佳提取率为38%左右[9]；苎麻品种“中苎2号”的叶片蛋白质提取效率达11.26%[10]。作为蛋白质改性的手段之一，超声处理还能提高蛋白质的部分功能特性[1,11]。根据蛋白的溶解特性，目前对植物蛋白的提取研究多采用碱溶液、盐溶液和水为提取剂[7,12]。王满生等[6]通过碱溶酸沉的方法提取青叶苎麻叶蛋白，其最佳叶蛋白溶出率达45.27%，最佳酸沉条件下叶蛋白溶出率达72.65%。

目前苎麻叶多为饲用，苎麻叶蛋白提取及功能特性等相关研究尚未见报道。研究拟以青叶苎麻叶片为研究对象，利用超声波简捷高效的优势辅助提取青叶苎麻叶蛋白，探究碱溶液、盐溶液和水对青叶苎麻叶蛋白质的提取效果及其乳化性、起泡性等功能特性的影响，以期为青叶苎麻中叶蛋白资源的有效开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青叶苎麻叶粉：过60目筛，中国农业科学院麻类研究所南方蛋白饲料植物资源开发与利用创新团队；

福临门大豆油：市售；

氯化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、甲基红、溴甲酚绿：分析纯，成都科隆化学品有限公司；

氢氧化钠、硫酸铜、碘化钾、硫酸钾、硼酸、酒石酸钾钠、无水乙醇：分析纯，成都金山化学试剂有限公司；

浓硫酸、盐酸：分析纯，西陇化工股份有限公司；

牛血清蛋白(BSA Albumin Fraction V)：纯度>98%，德国Bio Froxx公司；

离心机：TG-1850型，四川蜀科仪器有限公司；

电子天平：ESJ210-4A型，沈阳龙腾电子有限公司；

多功能微孔板检测仪：H1M型，美国BioTek Instruments公司；

消化炉：HYP-320型，上海纤检仪器有限公司；

自动型定氮仪：KDN-19F型，上海纤检仪器有限公司；

可调高速匀浆机：FSH-2A型，常州润华电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 苎麻叶蛋白的提取 分别采用超声波辅助碱溶液、盐溶液和水溶液进行提取。提取工艺参照谢艺潇等[7,12]的方法并适当修改。准确称取1.5 g苎麻粉于不同离心管中，按料液比1∶20(g/mL)分别加入0.1 mmoL/L 的NaOH溶液、5%的NaCl溶液和蒸馏水，振荡混匀， 150 W下超声60 min，6 000 r/min离心20 min，取上清液，4 ℃冰箱保存备用。每种提取液均设置3个平行。

1.2.2 蛋白质含量的测定 参照周欣悦[13]的方法稍作修改。准确称取牛血清蛋白溶解于蒸馏水中，分别配制成浓度为0.25，0.50，1.00，2.50，5.00，7.50 mg/mL的溶液，与配制好的双缩脲试剂以1∶4(体积比)混合，避光反应30 min，测定540 nm处吸光度，根据蛋白浓度和吸光度值计算得标准曲线方程Y=0.027 0X+0.099 2(R2=0.998 9)。

分别取适量碱提、盐提、水提取的苎麻叶蛋白质溶液，用对应提取剂稀释1倍，与双缩脲试剂以1∶4(体积比)混合，避光反应30 min，测定540 nm处吸光度，通过标准曲线方程计算溶液中蛋白质浓度。

1.2.3 氮溶解指数(NSI)的测定 参照杨希娟等[14]的方法稍加修改。准确称取苎麻粉末样品0.5 g，共12份，其中3份不作任何处理，另外9份按1.2.2的方法进行蛋白提取，将提取后的残渣于110 ℃下烘干，于消化管中将12份样品分别与3.0 g硫酸钾、0.2 g硫酸铜和20 mL浓硫酸混合，另取3支消化管分别加入3.0 g硫酸钾、0.2 g硫酸铜、20 mL浓硫酸作空白试验。样品消化程序：200 ℃ 10 min，420 ℃ 120 min。分别取50 mL 2%的硼酸溶液和3滴甲基红溴甲酚绿混合指示剂于250 mL锥形瓶，消化结束后待消化管冷却至室温，用自动型定氮仪进行定氮，用0.1 mol/L盐酸溶液滴定。按式(1)计算氮溶解指数。

(1)

式中：

NSI——氮溶解指数，%；

P1——提取后残渣中粗蛋白含量，g；

P——苎麻粉末样品中粗蛋白含量，g。

1.2.4 起泡性及泡沫稳定性的测定 参照王一博等[15-16]的方法稍加修改。分别将碱提、盐提、水提蛋白溶液稀释至蛋白质含量为2 mg/mL，取稀释后的溶液20 mL，10 000 r/min高速搅打2 min，然后迅速倒入量筒中，记录上层泡沫体积和搅拌停止时蛋白质溶液体积，静置30 min后，再次记录上层泡沫的体积，分别按式(2)、(3)计算起泡性及泡沫稳定性。

(2)

(3)

式中：

FP——起泡性，%；

SF——泡沫稳定性，%；

V0——搅拌停止时上层泡沫体积，mL；

V1——搅拌停止30 min后泡沫体积，mL；

V2——搅拌停止时蛋白质溶液体积，mL。

1.2.5 乳化性及乳化稳定性的测定 参照叶凤凌等[17-18]的方法稍加修改。取3 mL大豆油和9 mL已用对应提取溶剂稀释至2 mg/mL的蛋白质溶液于50 mL塑料离心管内混合，10 000 r/min均质2 min，分别在0，30 min时从离心管底部5 mm处取16 μL乳状液与4 mL 0.1%的SDS溶液混匀，测定500 nm处吸光值。分别按式(4)、(5)计算乳化性及乳化稳定性[19]。

(4)

(5)

式中：

EP——乳化性，m2/g；

SE——乳化稳定性；

D——稀释倍数，取125；

c——蛋白溶液中蛋白质浓度，g/mL；

φ——乳化液中油相的体积分数，取0.25；

A0、A30——0，30 min时的吸光值；

Δt——两次检测的间隔时间。

1.3 数据处理

每组试验重复3次，采用Office 2019、SPSS 19.0等软件对试验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 对蛋白质溶液浓度的影响

由图1可知，碱提、盐提和水提得到的蛋白质量浓度分别为9.99，10.73，9.53 mg/mL，说明盐提法得到的蛋白含量最高，碱提法次之，水提法最低。这主要是因为中性盐中和了蛋白质表面的电荷并破坏了水化膜，使蛋白凝集沉淀，且蛋白质提取过程中低浓度中性盐还可增加水的极性，进而使更多的蛋白质溶解至溶液中，最终提高了蛋白质提取率[20]。

2.2 对氮溶解指数的影响

由图2可知，水提法、盐提法和碱提法的氮溶解指数分别为56.96%，61.95%，55.09%，即盐提法>水提法>碱提法，与双缩脲法检测的蛋白提取液中蛋白含量的结果趋势相吻合。水提法和碱提法的青叶苎麻叶蛋白溶液的NSI值<60.00%，而盐提法的蛋白溶液的NSI值略>60.00%，说明这3种方法均不能完全提取出青叶苎麻原料中的蛋白质，可能与植物蛋白组分有关。植物蛋白多含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麦谷蛋白和残渣蛋白，其中球蛋白在盐溶液中溶解性较好，易被盐提溶出；清蛋白可被蒸馏水提取；麦谷蛋白可用碱性溶液提取[20]，因此推测青叶苎麻叶片中球蛋白含量较高。此外，提取原料中蛋白质含量过高会影响蛋白提取率，如高蛋白豆粕提取后的残渣蛋白明显高于低蛋白豆粕，且更高的蛋白含量会导致分离蛋白提取率有所降低[21]。青叶苎麻叶粉中蛋白质含量约为28.89%，属于高蛋白含量植物，故测得的样品NSI值较低,符合上述原因分析。

图1 提取方法对蛋白质溶液浓度的影响

2.3 对起泡性和泡沫稳定性的影响

由图3可知，相比于10 mg/mL浓度条件下的大豆分离蛋白的起泡性只有10%[22]，青叶苎麻蛋白质表现出更佳的起泡性，且盐提法蛋白质溶液的起泡性及泡沫稳定性均较佳。这可能是由于NaCl溶液可以与蛋白质发生相互作用，影响蛋白质的黏度、展开和聚集，进而对起泡性产生一定的影响[23]。同时，一定量的NaCl所提供的离子环境还可以增大蛋白质的溶解度，降低在气—液界面上未吸附蛋白质与吸附蛋白质之间的排斥力，有助于蛋白质吸附在泡沫的界面上而防止泡沫粗化，从而增强蛋白质溶液的起泡性和泡沫稳定性[24]。

由图3还可知，相比于水提法，碱提法蛋白质溶液的起泡性稍差，但其泡沫稳定性稍好，可能是水提法溶液的pH值更接近蛋白质的等电点，由于缺乏在界面和吸附分子之间的排斥力，被吸附到界面上的蛋白质数量增加，提高了蛋白质的起泡性，而碱提法的pH值略高，排斥作用降低，促进界面上蛋白质之间的相互作用形成黏度较大的膜，从而表现得更加稳定[25-26]。

2.4 对乳化性和乳化稳定性的影响

由图4可知，3种蛋白质溶液的乳化性分别为5.89，5.27，11.17 m2/g，其中水提法蛋白质的乳化性效果最好，而盐提法的乳化性效果不佳。3种蛋白质溶液的乳化稳定性分别为231.92，114.26，145.65。由于蛋白质的乳化性受溶解性和表面活性两个因素影响，碱提法的蛋白质提取液pH值有所升高，远离等电点，而远离等电点时蛋白质的溶解度增大，参与乳化作用的蛋白质也随之增多，因此碱提法蛋白质溶液有较好的乳化性及乳化稳定性[27]。而盐提法蛋白质溶液，其乳化性和乳化稳定性均比另外两种提取方法有一定程度的降低，这一情况与邓塔等[28]的结果类似。这可能是盐溶液中的离子破坏了乳状液中液滴表面电荷平衡，液滴间无法保持平衡，乳化稳定性减小。当食盐浓度≥0.5 mol/L时，可能会促进脂肪之间的加速融合，从而降低蛋白质溶液的乳化稳定性[29]。

图2 提取方法对NSI值的影响

图3 提取方法对蛋白质起泡性和泡沫稳定性的影响

图4 提取方法对蛋白乳化性及乳化稳定性的影响

3 结论

研究了超声波辅助碱溶液、盐溶液和水对青叶苎麻叶蛋白的提取效果。结果表明，低浓度的中性盐溶液可增加水的极性，从而促进蛋白质的溶解并提高其提取率，根据植物蛋白组分的溶解特性，推测青叶苎麻叶片中球蛋白含量较高。青叶苎麻叶蛋白含量约为28.89%，3种溶剂提取的蛋白质的氮溶指数均较低，且盐提法(61.95%)>水提法(56.96%)>碱提法(55.09%)。3种提取法的青叶苎麻叶蛋白的起泡性均优于10 mg/mL浓度条件下的大豆分离蛋白的起泡性(10%)，且盐提法的青叶苎麻叶蛋白的起泡性及泡沫稳定性均优于其他两种提取方法。后续可进一步明确青叶苎麻叶蛋白组分的结构和功能性质，为青叶苎麻叶的开发利用提供更多的理论依据。