丁香酚对水产品中普罗威登斯菌的抑制作用

图尔荪阿依·图尔贡 王 帆 付龙龙努尔古丽·热合曼 刘小莉

(1. 新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2. 江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；3. 江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017)

普罗威登斯菌(Providenciavermicola)是一类能够导致食品腐败变质的革兰氏阴性腐败菌，属于肠道杆菌科，为条件致病菌，广泛存在于土壤、水体、食品中，不仅影响食品质量安全，还会引起人体腹泻、肠道内微感染、尿道感染等[1-2]。何鹏晖等[3]发现普罗威登斯菌在腐败发酵蔬菜中具有产醭特性。施荷等[4]研究表明，冷却鹿肉贮藏初期会产生普罗威登斯菌，且在贮藏中期活力逐渐增强，是冷却鹿肉贮藏末期的优势菌属。黄佳奇[5]研究表明，不同包装条件下小黄鱼表面优势腐败菌差异较大，普罗威登斯菌是空气包装小黄鱼的优势腐败菌之一。课题组[6]从自然腐败的香辣蟹样品中分离鉴定出一株普罗威登斯菌，且食品工业中常用的化学防腐剂如苯甲酸钠、山梨酸钾等，以及生物保鲜剂乳酸链球菌素(Nisin)对该菌没有抑制作用。

丁香酚(Eugenol)是一种热稳定性好、毒性较低、不易残留的天然香料。作为丁香精油的主要成分，丁香酚对导致食品腐败的多种细菌和真菌具有较强抑制作用[7-8]，如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、福氏痢疾杆菌、鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌、李斯特菌、沙克乳酸杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等细菌以及根霉菌、链格孢菌、灰霉菌等，因而常被用于食品的防腐保鲜[9-11]。试验拟以前期从香辣蟹样品优势腐败菌中分离的普罗威登斯菌作为指示菌，研究并探讨丁香酚对普罗威登斯菌的抑制效果及抑菌机理，为后续丁香酚应用于水产保鲜提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普罗威登斯菌：从自然腐败的香辣蟹样品中分离鉴定，菌株编号XLX5，16S rDNA序列结果提交至GenBank核酸数据库得到Accession number为KC456588，保藏于江苏省农业科学院农产品加工研究所食品生物工程研究室；

丁香精油：丁香酚含量85%，批号2017030102，用乙醇溶解并配成有效浓度为1 mg/mL母液，江西金源天然香料有限公司；

乳酸链球菌素(Nisin)、山梨酸钾、苯甲酸钠、壳聚糖、苹果酸脱氢酶(MDH)酶活测定试剂盒、琥珀酸脱氢酶(SDH)酶活测定试剂盒、考马斯亮蓝蛋白浓度测定试剂盒：南京建成生物试剂有限公司；

BCA蛋白浓度测定试剂盒：南京天为生物科技有限公司；

营养肉汤培养基：北京奥博星生物有限责任公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪：Epoch型，美国Bioteck公司；

扫描电子显微镜：MERLIN型，德国ZEISS公司；

日立透射电镜：HT7700型，日本Hitachi公司。

1.3 试验方法

1.3.1 普罗威登斯菌悬浮液的制备 将P.vermicola接种于无菌营养肉汤培养基中，37 ℃，150 r/min下活化培养24 h，用新鲜无菌营养肉汤培养基调整菌悬液细菌浓度为1×107CFU/mL，备用。

1.3.2 体外抑菌试验 采用平板孔阱扩散法初步测定抗菌活性。按1%接种量将活化好的P.vermicola菌悬液接种至无菌营养肉汤固体培养基中，倒平板。待培养基冷凝后，用直径为7 mm的打孔器于平板上均匀打出3个孔，分别吸取50 μL 1 mg/mL丁香酚、Nisin、山梨酸钾、苯甲酸钠、壳聚糖注入孔中，37 ℃培养24 h后测量抑菌圈大小，重复3次取平均值[12]。

1.3.3 丁香酚最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定 根据文献[13]确定丁香酚最小抑菌浓度(MIC)。将丁香酚用无菌营养肉汤液体培养基稀释至终浓度分别为1.000，0.500，0.250，0.125，0.063，0.031 mg/mL，备用。向96孔板中分别加入100 μL不同浓度的丁香酚稀释液，再加入100 μL菌浓度为1×107CFU/mL的P.vermicola菌悬液。分别设置阴性对照(100 μL菌悬浮液+100 μL营养肉汤)和空白对照(200 μL营养肉汤)，37 ℃ 培养24 h。以阴性对照中P.vermicola生长呈浑浊和空白对照透明为前提，其他孔内培养物浑浊情况判断最小抑菌浓度。从96孔板中取样液浑浊度明显减少的丁香酚溶液，涂布接种至无菌的固体营养肉汤平板中，37 ℃培养24 h，未见菌落生长的为最低杀菌浓度(MBC)，重复3次。

1.3.4 丁香酚对菌体的处理 取96微孔板，每孔加入100 μL菌浓度为1×107CFU/mL的菌悬液及100 μL丁香酚溶液，丁香酚溶液终浓度分别为1 MIC、2 MIC。分别设置阴性对照(100 μL菌悬浮液+100 μL营养肉汤)和空白对照(200 μL营养肉汤)，于37 ℃、150 r/min摇床培养24 h。

1.3.5 丁香酚对菌体生长曲线的影响 取96微孔板，每孔加入100 μL菌浓度为1×107CFU/mL的菌悬液及100 μL丁香酚，丁香酚终浓度分别为1 MIC、2 MIC。分别设置阴性对照(100 μL菌悬液+100 μL营养肉汤)和空白对照(200 μL营养肉汤)，置于37 ℃培养箱静止培养。每2 h用酶标仪测定620 nm处OD值，重复3次取平均值。

1.3.6 丁香酚对普罗威登斯菌形态的影响

(1) 样品前处理：将1.3.4中培养物于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，收集菌体。以磷酸盐缓冲溶液(0.01 mol/L，pH 7.0)洗涤菌体3次。所得菌体置于4 ℃、2.5%戊二醛中过夜固定。固定好的细菌用pH 7.0磷酸缓冲液漂洗3次，每次静置10 min，除去戊二醛。

(2) 扫描电镜观察：将1.3.6(1)样品依次置于30%，50%，70%，80%，90%，100%的乙醇中脱水置换，每次15 min。脱水后临界点干燥，将干燥的菌体固定至金属台上，用离子溅射仪对喷金、镀膜，采用扫描电子显微镜进行观察。

(3) 透射电镜观察：将1.3.6(1)样品置于1%四氧化锇中固定3 h；除去固定剂的样品分别经体积分数为50%，70%，80%，90%，100%的乙醇脱水，每次15 min，继续用100%丙酮溶液脱水3次，用Epon812固定剂进行包埋，超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双染色后，采用透射电子显微镜进行观察和图像采集。

1.3.7 丁香酚对普罗威登斯菌内容物泄露的影响 取96微孔板，每孔加入100 μL菌浓度为1×107CFU/mL的菌悬液及100 μL丁香酚溶液，丁香酚溶液终浓度分别为0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC。分别设置阴性对照(100 μL菌悬浮液+100 μL营养肉汤)和空白对照(200 μL营养肉汤)，于37 ℃、150 r/min摇床培养24 h。将丁香酚处理组和空白对照组培养物于4 ℃、4 000 r/min离心10 min。取上清分别测定260，280 nm处OD值。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上清液中可溶性蛋白含量。

1.3.8 菌体内苹果酸脱氢酶(MDH)酶活和琥珀酸脱氢酶(SDH)酶活变化 将收集的对数期P.vermicola用0.75% 生理盐水洗涤重悬为1×107CFU/mL的菌悬浮液，添加丁香酚使其终浓度为1 MIC，未添加丁香酚作为空白对照，于37 ℃、150 r/min振荡培养24 h。取菌悬液10 000 r/min低温离心10 min，收集菌体，并用0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液洗涤3次，每组试验平行3次。加入与菌体等体积的2 mg/mL的溶菌酶溶液，搅拌均匀，37 ℃水浴15 min后，迅速冰浴，加入等体积的0.1 mol/L SDS Tris-HCl(pH 9.0)缓冲液，10 000 r/min低温离心15 min，取上清液备用。按试剂盒说明书方法进行MDH、SDH酶活检测。

1.4 数据分析

采用SPSS软件整理数据并进行方差分析和差异显著性检验(P<0.05)，采用OriginPro 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 体外抑菌试验

抑菌试验结果显示，丁香酚处理组透明抑菌圈可达(21.6±0.3) mm，抑菌作用显著。壳聚糖处理组可延缓P.vermicola生长，但不能完全抑制，表现为平板上出现模糊的抑菌圈；Nisin、山梨酸钾、苯甲酸钠处理组均没有出现透明抑菌圈，说明三者对P.vermicola没有抑菌活性。当丁香酚浓度>0.25 mg/mL时，P.vermicola处理组孔内培养物比阴性对照组清澈，由此确定最低抑菌浓度为0.25 mg/mL；当丁香酚浓度为0.5 mg/mL时，平板上没有菌落生长，故最低杀菌浓度为0.5 mg/mL。

2.2 生长曲线

由图1可知，对照组的OD值在8 h内显著升高，进入对数生长期(P<0.05)。与对照组(CK)相比，0.5，1.0 MIC 丁香酚处理组分别于20，18 h后进入对数生长期且菌体生长速度明显延迟于对照组，而2.0 MIC组的OD值几乎没有增加。这表明丁香酚可以抑制P.vermicola的生长并延迟细菌对数期的生长时间。

图1 丁香酚对普罗威登斯菌生长曲线影响

2.3 丁香酚对普罗威登斯菌形态的影响

2.3.1 扫描电镜 由图2可知，与对照组相比，丁香酚处理P.vermicola菌体表面发现皱纹、菌体不饱满、缺乏充盈感，少量细胞出现损坏，菌体表面粗糙、不光滑，菌体周边呈现明显的内容物泄漏。

2.3.2 透射电镜图 由图3可知，未经丁香酚处理的P.vermicola细胞饱满，有完整的细胞结构，细胞大小均一且形状规则，细胞壁、细胞膜和核区层次分明且清晰可见，细胞质、内容物分布均匀且充实致密，细胞核紧实并且均匀分布于细胞中间。而经丁香酚处理后，菌体细胞开始出现皱褶，细胞质出现不集中，细胞壁分解不明显，细胞壁和细胞膜变薄，边界不清晰，质壁之间出现小的间断，有小的空白区，细胞质含量减少并且分布不均，核区分布逐渐分散，聚拢并且边聚，出现小的空洞。

2.4 内容物泄漏

细胞壁和细胞膜具有保护细菌的作用，是细菌正常生长的基本保障。细菌壁膜系统一旦遭到破坏，会造成分布于细菌内部的许多重要生物大分子如：核酸、蛋白质、糖类等的外流，影响细菌合成代谢功能。通过测定渗漏至细胞外相关生物大分子含量变化，可以反映细菌壁膜系统的完整性[14]。嘌呤环和嘧啶环中均含有共轭双键，核酸在260 nm处对紫外线有最大吸收值；氨基酸中含有共轭双键的色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在紫外线280 nm处，因此OD260 nm、OD280 nm值可反映菌体内核酸和蛋白质物质泄漏情况。

由图4可知，与对照组相比，经不同浓度丁香酚处理18 h后，普罗威登斯菌培养物上清液OD260 nm、OD280 nm值以及可溶性蛋白含量均不同程度增加，2.0 MIC 丁香酚处理后OD值以及蛋白含量显著增加(P<0.05)，说明丁香酚能够作用于P.vermicola的壁膜系统，导致细菌壁膜系统遭到损伤，造成细胞内大分子物质外流。

图2 普罗威登斯菌扫描电镜图

图3 普罗威登斯菌透射电镜图

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.5 苹果酸脱氢酶(MDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)酶活变化

由表1可知，与对照组相比，P.vermicola丁香酚处理组MDH和SDH酶活均显著下降，其作用机理可能是丁香酚影响MDH和SDH的分子结构，使其发生变化，改变构像，降低酶活性[15]。由此可推断，丁香酚通过降低MDH和SDH酶活力，破坏细胞的能量代谢途径，抑制P.vermicola生长。

表1 丁香酚对普罗威登斯菌MDH和SDH酶活的影响†

3 结论

以一株分离自水产品中的普罗威登斯菌为研究对象，研究丁香酚对其的抑菌效果。结果表明，丁香酚对普罗威登斯菌有一定的抑制作用，且抑制效果具有剂量依赖性，最低抑制浓度为0.25 mg/mL。丁香酚促使普罗威登斯菌菌体严重变形，破坏菌体的完整性，使胞内物质泄漏，胞外可溶性蛋白含量提高，引起细胞内部渗透压不稳定，进而影响细菌胞内生理生化反应，以及胞内维持细胞正常生长代谢相关的酶类，如苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶酶活的降低，从而表现出抑菌特性。丁香酚对水产品中普罗威登斯菌抑菌效果显著，其抑菌机理与影响细菌细胞壁、细胞膜的通透性和完整性，干扰细菌生理代谢活动有关。后期可开展丁香酚在香辣蟹产品中应用相关研究。