自然发酵苹果酵素理化指标和抗氧化活性动态分析

张海燕

摘要：为了明确苹果酵素自然发酵过程中理化指标和抗氧化活性的变化规律，阐明苹果酵素保健功能机理，研究了苹果酵素的可溶性固形物含量、pH、总酸含量、乙醇含量、DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基清除能力的动态变化。结果表明，随着发酵时间的延长，可溶性固形物含量和pH逐渐降低，发酵90 d时，可溶性固形物含量降为4.5   °Brix，pH下降至3.06，比发酵初期分别降低了70%和32%;总酸含量逐渐升高，发酵90 d时增加至42.9 g/L，较发酵初期增加了98%;乙醇含量先升高后降低，发酵90 d时为 1.0 g/L，符合QB/T5323-2018中有关乙醇的规定。发酵75～90 d时的抗氧化活性较好，DPPH自由基和羟基自由基在发酵90 d时的清除率分别为86.16%和79.03%，较发酵初期升高了44.5%、45.53%;超氧阴离子自由基和ABTS自由基的清除率发酵75 d时达到峰值，分别为65.06%和69.04%，较发酵初期分别升高了39.12%和46.47%。

关键词：苹果酵素;自然发酵;理化指标;抗氧化活性

中图分类号：TQ925;S661.1 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2020）11-0037-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.11.009

Abstract：In order to study the changes of physicochemical indexs and antioxidant activities of Apple Jiaosu during natural fermentation process and clarify the health function mechanism of malenzyme， the dynamic changes of the soluble solids content， pH， total acid content， ethanol content， DPPH free radicals， hydroxyl free radicals， superoxide anion free radicals， and ABTS free radicals were investigated. The results showed that the soluble solid content and pH value decreased gradually with the extension of fermentation time. After 90 days of fermentation， the soluble solid content dropped to 4.5 °Brix and the pH dropped to 3.06， which were reduced by 70% and 32% respectively compared with the initial stage of fermentation. The total acid content gradually increased， increased to 42.9 g/L after 90 days， and increased 98%. the ethanol content first increased and then decreased， it was achieved to 1.0 g/L， after 90 days， and complied with regulations of QB/T5323-2018. The antioxidant activities were reached the better in fermentation to 75～90 days. The free radical scavenging rates of DPPH and hydroxyl were reached to 86.16% and 79.03% after 90 days， and increased 44.5% and 45.53%， respectively. The superoxide anion and ABTS were peaked at fermentation 75 days（65.06% and 69.04%， respectively）， which were increased 39.12% and 46.47%. The study would provide some theoretical basis for further elucidating the health function mechanism and comprehensive development of Apple Jiaosu.

Key words：Apple Jiaosu;Natural fermentation;Physicochemical indexs;Antioxidant activities

食用植物酵素（edible plant Jiaosu）是指以可用于食品加工的植物为主要原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人来食用的酵素产品[1 - 2 ]。其在含有植物本身的多种维生素、酶和矿物质等营养物质的同时，还通过微生物发酵产生新的次生代谢物及活性成分，与直接食用蔬菜水果相比，酵素中的生物活性成分和有机小分子更为浓缩，而且更容易为人体所吸收[3 ]。食用植物酵素作为一种功能性微生物发酵制品因其丰富的营养和显著的功效多年来盛行于欧美、东南亚、日本以及台湾地区，受到国内外学者的普遍关注[4 ]。目前有关自然发酵苹果酵素的研究多以短期发酵为主，杨小幸等[5 ]在发酵第 21 天时获得了较高总酚含量与 DPPH自由基清除率的苹果酵素，李飞等[6 ]研究发现，发酵50 d的苹果酵素的抗氧化活性基本呈现上升趋势。但以上研究由于发酵周期较短，产品品质不稳定，酒精含量容易超标，而且研究表明，酵素是时间的产物，随着发酵时间的延長，产品中的活性物质逐渐增加[7 - 11 ]，因此进一步阐明苹果酵素自然发酵过程中理化指标和抗氧化活性的动态变化很有必要的。笔者以富士苹果为原料，研究了苹果酵素自然发酵过程中理化指标和抗氧化活性的变化，以期为进一步阐明苹果酵素保健功能机理和综合性开发提供依据。

1   材料与方法

1.1   材料与试剂

指示富士苹果品种为长富2号，采自甘肃省庆阳市有机苹果基地之一的庆阳市西峰区什社乡。供试冰糖为市售，供试纯净水为自制。供试氢氧化钠、酚酞、DPPH、乙醇、ABTS、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯化铁、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、Tris、邻苯三酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均由中瑞化学试剂公司提供，均为分析纯。

1.2   仪器与设备

UV-1100型紫外可见分光光度计（上海凌析达仪器有限公司）、LRH-70 型恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、YXQ-LS- 75G 型立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、DK-S24 数显恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、 MIRCOCL 17R 离心机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]、超低温冰箱（青岛海尔集团）、DL-CJ- 1N超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、PB-10型精密pH计[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.3   试验方法

1.3.1    苹果酵素生物发酵生产工艺流程    苹果原料选择→清洗→去核→切分→装罐→加水、加糖→发酵→过滤→成品。

1.3.2    操作要点    新鲜苹果用纯净水冲洗干净，沥干水分后去核并切分成 3～5 mm的片，冰糖破碎后用紫外灯辐照处理30 min。将苹果片与纯净水按质量比200∶1 000加入无菌酵素发酵罐中，加入15%的冰糖调节糖度，置阴凉干燥的发酵车间，常温（20～26 ℃）下自然发酵30 d后滤去果肉（防止产生过多不利于健康的氨氮等），继续发酵至90 d。发酵第1个月隔天搅拌通气，第2个月有氧发酵，之后密封发酵，发酵结束取上清液进行指标测定。每组试验均重复3次。

1.3.3    理化指标变化    总酸含量参照GB/ T12456 — 2008的方法测定[12 ]，pH采用pH计法测定，可溶性固形物含量采用糖度计法测定[13 - 14 ]，乙醇含量采用密度瓶法测定[15 ]。

1.3.4    抗氧化活性测定    DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羟基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力测定均参考樊秋元[16 ]的方法。

1.4   统计学处理

试验数据采用Excel 2010、SPSS 22.0数据分析软件进行分析处理及作图。

2   结果与分析

2.1   苹果酵素自然发酵过程中的理化指标变化

可溶性固形物、pH、总酸、乙醇等是衡量苹果酵素发酵成熟的主要理化指标，也是影响酵素品质的重要因素[17 - 18 ]。由图1可以看出，可溶性固形物含量随着发酵时间的延长呈现不断下降的趋势[19 ]，发酵30 d内营养充分，微生物快速繁殖，迅速消耗碳水化合物，使酵素液中可溶性固形物含量迅速从15.0 °Brix降至7.2 °Brix;随后缓慢降低，发酵90 d时可溶性固形物含量降为4.5 °Brix，比发酵初期降低了70%。 pH随着发酵时间的延长而逐渐降低，发酵前30 d迅速从4.50降低至3.22，说明微生物在发酵前期为大量繁殖阶段，随后由于有机酸的积累pH平稳下降至发酵结束时的3.06，与发酵初期相比，pH下降了32%，同时因为微生物的生长代谢产生的二氧化碳在水中形成气泡，可能由于气泡的不稳定性，致使pH在下降的同时也出现回升的情况[17 ]。总酸在发酵前30 d逐渐升高，从最初的0.9 g/L升高至3.2 g/L，这可能是因为发酵前期为通气发酵阶段，微生物代谢产生的二氧化碳和有机酸使得总酸含量逐渐升高;发酵30～60 d总酸含量快速升高至36.7 g/L，此阶段为有氧发酵阶段，发酵液中的乙醇、己糖等代谢产物通过微生物发酵转化为乙酸和乳酸等有机酸，既提高了苹果酵素的营养物质，又形成其独特的风味[17 ];随后由于发酵缓慢，总酸含量略有升高，至发酵结束总酸含量达到42.9 g/L，与发酵初期相比总酸含量增加了98%。乙醇含量随着发酵时间的延长呈先升高后降低的趋势，发酵30 d内碳水化合物含量高，微生物发酵产生大量的乙醇，导致乙醇含量从0迅速增加至79.0 g/L，随后通过有氧发酵促使乙醇生成乙酸，乙醇含量迅速降低至13.0 g/L，60 d后缓慢降低，在发酵90 d时乙醇含量为1.0 g/L，符合QB/T5323 — 2018有关规定。

2.2   苹果酵素自然发酵过程中抗氧化能力的变化

通过比较分析DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率、ABTS自由基清除率等4种抗氧化活性体系，对苹果酵素自然发酵过程中抗氧化能力进行评价。由图2可以看出，DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率、ABTS自由基清除率在苹果酵素发酵过程中抗氧化能力变化规律大体较为一致，DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率发酵前60 d逐渐上升，60 d后趋于稳定上升;发酵90 d时自由基清除率分别从发酵初期的47.82%和43.05%上升至86.16%和79.03%，升高了44.50%和45.53%。超氧阴离子自由基清除率和ABTS自由基清除率发酵前75 d逐渐上升并达到峰值，分别为65.06%和69.04%，與发酵初期相比分别升高了39.12%和46.47%，随后略有降低。说明发酵75～90 d时的苹果酵素抗氧化活性较好，这可能与该阶段通过微生物代谢酵素中积累了较多的抗氧化物质、功效酶以及微生物的多样性有关[20 ]。

3   结论与讨论

研究表明，苹果酵素自然发酵过程中，30 d内酵素液中碳水化合物充足，微生物迅速生长繁殖，可溶性固形物含量和 pH迅速降低;随后进入平稳变化阶段，总酸含量逐渐升高，乙醇含量先升高后降低，发酵至60 d时才逐渐进入平稳变化阶段。在发酵90 d时，可溶性固形物含量降为4.5 °Brix，与发酵初期相比降低了70%，pH下降至3.06，降低了32%;总酸含量增加至42.9 g/L，增加了98%，乙醇含量为 1.0 g/L，符合QB/T5323 — 2018规定。苹果酵素发酵75～90 d时抗氧化活性较好， DPPH自由基和羟基自由基在发酵90 d时清除率分别为86.16%和79.03%，分别升高了44.5%、45.53%;超氧阴离子自由基清除率和ABTS自由基的清除率呈现发酵前75 d逐渐上升达到峰值，分別为65.06%和69.04%，分别升高了39.12%和46.47%，这可能是由于通过微生物代谢酵素中积累了较多的抗氧化物质和功效酶，并且微生物多样性较好[21 - 22 ]。有关抗氧化物质如总酚、总黄酮，功效酶如超氧化物歧化酶（SOD）活性等以及微生物多样性与抗氧化活性之间的关系有待于研究。

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（本文责编：郑立龙）