葛花醇提液对离体蛙心收缩功能的影响

谭 娟 ， 向德标 ， 袁袆玲 ， 徐梦婷

（1.怀化学院生物与食品工程学院；2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室；3.湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室，湖南怀化 418008）

葛花又名葛条花，为豆科植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）或甘葛藤（P.thomsonii Benth）的干燥未开放花蕾[1].据《中国药典》记载，葛花为药食同源植物，是一种纯天然的野生植物，性凉，味甘，入阳明经，如脾胃等，也是我国传统民间草药和保健饮料植物[2].现代药理学研究表明，葛花的主要活性成分为总黄酮和皂苷类，而黄酮类成分含量最高，黄酮里葛根素亦是主要成分[3].已有报道表明，葛花总黄酮对体内活性氧自由基（ROS）的产生有抑制作用，可提高组织抗氧化能力，不仅可预防和治疗衰老性疾病[4]，同时具有明显预防酒精性肝损伤、扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量、改善心肌功能的作用，对心血管具有保护作用等[5，6].

葛花药用疗效较为广泛，有较高的科研价值，但在现代中医药研究中对于葛花的研究仍然不够深入，在其质量标准、作用机理等方面有必要展开进一步研究.本实验采用离体蛙心灌流经典实验，借助BL-420F生物机能实验系统，通过对比观察不同浓度葛花醇提液对离体蛙心收缩功能的影响，以及葛花醇提液与心肌膜上受体的关系，对心脏收缩的机制进行探讨，以期为葛花的深入开发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

葛花为江西省上饶市售野生干葛花.由怀化学院刘良科教授鉴定为野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）.

实验动物为美国青蛙（Rana grylio），雌雄不限，体重（350±50 g），购于怀化本地.由怀化学院向孙军副教授鉴定.

1.2 仪器

FY130药物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；蛙心插管（成都泰盟科技有限公司）等.

1.3 实验药品

1/5000盐酸肾上腺素注射液（远大医药（中国）有限公司，批号：151209）；1/10000乙酰胆碱（博美生物医药有限公司，批号：Sigma A 6625）；0.4 mg/mL硫酸阿托品注射液（杭州民生药业有限公司，批号：T16F027）；0.1 mg/mL盐酸普萘洛尔（江苏亚邦爱普森药业有限公司，批号：1603084）；0.5 mg/mL盐酸苯海拉明（临汾宝珠制药有限公司，批号：141001）；0.4 μg/mL 甲磺酸酚妥拉明（上海旭东海普药业有限公司，批号：D160204）；任氏液：参考《药理学》[7]配方配制（1 000 mL蒸馏水中NaCl 6.50 g、KCl 0.14 g、CaCl20.12 g、NaHCO30.20 g、NH2PO40.01 g、葡萄糖2 g），所用试剂均为化学纯试剂.

1.4 实验方法

1.4.1 葛花醇提液的制备

参考李胜华[8]的浸提方法制备葛花醇提液.将干葛花充分粉碎，60目过筛，取细小粉末100.0 g，缓慢加入1 000 mL的60%乙醇溶液，边搅拌边混匀，保鲜膜密封，浸泡24 h，期间不定时混匀.利用真空泵将浸提液抽滤，双层滤纸，抽滤两次，旋转蒸发仪去除乙醇，浓缩定容至100 mL，得到粗提物浓度即为1.0 g/mL，待完全冷却后置于冰箱（4～6℃）保存备用，使用前依次稀释所需浓度.

1.4.2 葛花醇提液对离体蛙心收缩功能的影响

用斯氏法[9]制备离体蛙心，连接到BL-420F生物机能实验系统.记录正常蛙心自主收缩曲线为对照.实验时，待蛙心收缩曲线稳定后将任氏液全部吸出，然后往其中注入一定体积的葛花醇提液，观察记录，产生变化后至少稳定10-15个波形，然后吸出全部作用液，再用任氏液彻底灌洗，待波形稳定后，再进行下一次给药.根据预实验结果将葛花醇提液作用浓度范围确定为0.5-50 mg/mL.在有效浓度范围内用同样方法再确定不同浓度葛花醇提液对离体蛙心收缩功能的影响.实验数据采用区间测量法，测定记录给药前和给药后10个波形的张力峰值和心率变化情况，并根据公式计算张力变化率和频率变化率，变化率公式如下：

变化率=（葛花醇提液灌流时的收缩张力或心率-任氏液灌流时的收缩张力或心率）/葛花醇提液灌流时的收缩张力或心率×100%

变化率为正值，表示收缩力或心率增加；变化率为负值，表明收缩力或心率减慢.

1.4.3 葛花醇提液对加入不同受体阻断剂后离体蛙心收缩功能的影响

根据1.4.2的实验结果选取促进蛙心收缩作用明显的葛花醇提液浓度（2.5 mg/mL），参考齐梁煜[10]的方法，分组后分别加入一定浓度和体积的阻断剂阻断相应的受体后，再加入2.5 mg/mL的葛花醇提液，对比观察记录，探讨葛花醇提液对加入不同受体阻断剂阻断相应受体后离体蛙心收缩功能的影响.

1.5 数据分析

试验数据均以平均数±标准差（X±SD）来表示，应用SPSS18.0软件进行单因素方差分析，运用Duncan’s复极差法进行组内收缩张力差异显著性检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著.

2 结果与分析

2.1 不同浓度葛花醇提液对离体蛙心收缩力的影响

表1 不同浓度葛花醇提液对离体蛙心收缩张力的影响（X±SD，n=10）

图1 不同浓度葛花醇提液对离体蛙心收缩力的影响

由图1和表1可知，在正常条件下，离体蛙心收缩正常而稳定，给药后其收缩波形呈现不同程度的变化，添加低浓度（0.5～5.0 mg/mL）的葛花醇提液能有效促进离体蛙心收缩，且在2.5 mg/mL时促进作用最显著（P＜0.01），但在10 mg/mL时离体蛙心收缩受到抑制，且随着浓度增高，抑制作用增强，差异极显著.因此，不同浓度葛花醇提液对离体蛙心表现为低浓度促进收缩、高浓度抑制收缩，即具有“双向调节”作用.

2.2 不同浓度葛花醇提液对离体蛙心心率的影响

由表2可知，在正常条件下，离体蛙心收缩稳定，给药后，心肌心率无明显变化规律，表明在此浓度范围内的葛花醇提液对离体蛙心的心率无显著影响（P＞0.05）.

2.3 葛花醇提液对加入不同受体阻断剂后离体蛙心收缩活动的影响

根据表1结果可知，2.5 mg/mL葛花醇提液可明显促进心肌收缩力，待离体蛙心收缩平稳后，分别加入不同的受体阻断剂：如图2Ⓐ，加入硫酸阿托品（M型胆碱能受体阻断剂）后，收缩幅度显著降低，在此基础上，加入2.5 mg/mL葛花醇提液，未见其收缩活动明显增强（P＞0.05），表明M受体阻断后，葛花醇提液无法正常与M受体结合导致无法促进心肌收缩，推测葛花醇提液作用可能与阻断M受体有关；如图2Ⓑ，加入盐酸苯海拉明（组胺H1受体阻断剂）后，心肌收缩受到显著抑制（P＜0.01），再加入葛花醇提液后离体蛙心收缩作用显著增强（P＜0.05），但收缩波形为不规则收缩，表明葛花醇提液作用可能与H1受体无关，在H1受体阻断后仍能促进心肌收缩；如图2Ⓒ，同样方法，在另一个离体蛙心中加入盐酸普萘洛尔（β受体阻断剂）可见离体蛙心收缩受到显著抑制（P＜0.01），之后加入葛花醇提液，离体蛙心收缩抑制作用逐渐回升（P＜0.05），表明葛花醇提液作用可能与β受体无关；如图2Ⓓ，加入甲磺酸酚妥拉明（α受体阻断剂）后，收缩幅度显著降低，同样方法加入葛花醇提液后，离体蛙心收缩无明显变化（P＞0.05），没有表现促进作用，表明葛花醇提液作用可能与α受体有关.

表2 不同浓度葛花醇提液对离体蛙心心率的影响（X±SD，n=10）

图2 葛花醇提液对不同阻断剂阻断受体后离体蛙心收缩活动的影响

3 讨论

心脏接受交感、副交感神经双重支配，且支配心脏的各个部分不对称，如右侧交感神经兴奋时以增快心率为主，对心肌收缩力影响不大，而左侧交感神经兴奋时以加强心肌收缩力的效应为主，对心率影响不大[11].本研究结果表明不同浓度的葛花醇提液对离体蛙心心肌收缩力有明显的效应，对心率没有明显影响，推测可能是葛花醇提液中有大量活性成分刺激左侧交感神经，从而对蛙心收缩起主导作用.

已有报道，不同的神经通过释放激素作用于心肌膜上的受体而发挥作用.随着免疫组化技术的不断进步以及研究的不断深入，越来越多的受体类型被发现，一种类型受体又分为不同亚型[12].比如心肌膜上的肾上腺素能受体（AR），因与特异性蛋白胨亲和性、激动后信号转导机制及生物学效应存在差异性而分为α-AR和β-AR两型，这两种类型受体作用机制存在明显差异[12，13].本实验研究表明，分别加入受体阻断剂甲磺酸酚妥拉明（PM）和盐酸普萘洛尔后，再加入葛花醇提液，心肌表现存在明显差异，而PM是肾上腺素能α-AR受体的阻断剂，盐酸普萘洛尔是β-AR的阻断剂，可见葛花醇提液可能是通过与α-AR受体结合并使之兴奋，促使心室肌细胞动作电位0相上升速率加快，即对快钠电流起促进作用，使心肌细胞间传导加快，心肌细胞的兴奋性增强，从而促进心肌收缩[13].

M受体也存在M1、M2多种亚型，不同亚型受体兴奋后对心肌表现为负性或正性作用[14].当加入硫酸阿托品和2.5 mg/mL葛花醇提液时，心肌收缩没有显著增加，可见葛花醇提液无法阻断毒蕈碱型受体（M受体），从而无法促进心肌收缩.推测可能是由于葛花醇提液中有活性成分通过偶联G蛋白，从而降低腺苷酸环化酶（AC）的活性，进而降低cAMP含量，从而促进心肌收缩；也可能是直接阻断毒蕈碱型钾通道，使K+外流加速，进而Ca+内流或Na+内流造成心肌收缩[15]，具体原因有待于进一步研究.