朝仓花椒CBL基因家族的鉴定及分析

2020-12-052

种子 2020年11期

(1.贵州大学生命科学学院/茶学院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室/贵州省农业生物工程重点实验室，贵阳 550025;2.贵州省农业科学院，贵阳 550006)

Ca2+广泛存在于植物体内的各个部位，参与植物生长、发育和逆境胁迫应答过程，是植物信号转导中重要的第二信使[1]。类钙调磷酸酶B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)是高等植物中已发现的3种主要Ca2+传感蛋白之一，可对细胞内Ca2+的浓度变化进行识别和放大，进而将信号向下游转导，从而对植物生命活动进行调控[2]。CBL蛋白与丝/苏氨酸蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase，CIPK)相互作用形成蛋白激酶复合物来响应逆境胁迫，通过感受细胞内Ca2+浓度变化来调节下游逆境相关基因的表达，实现对逆境胁迫的转录调控[3-5]。CBL基因最早在拟南芥中发现[6]，随后CBL基因的鉴定和相关研究在冰叶日中花[7]、苹果[8]、小麦[9]、水稻[10]、胡杨[11]等多种植物中相继展开，对已知的CBL基因家族进行比对分析可知，CBL基因家族具有典型的EF-hand结合结构域，该结构域具有稳定蛋白结构和增加其对钙亲和力的双重作用[12,13]。

朝仓花椒(ZanthoxylumpiperitumDC. var.inermeMakino)是芸香科花椒属山椒种植物，具有无刺、丰产性显著及抗逆性强等优点，有较高的经济价值。花椒种类繁多，除朝仓花椒外，研究主要集中在产业化和种植方面，对其分子机理研究相对较少，且主要集中在花椒种中，如关淑文等[14]对竹叶花椒ZaGGPPS基因克隆与表达分析的研究，蒋弘刚等[15]对大红袍花椒皮刺分化转录组测序及数据分析，杨辉等[16]对蚬壳花椒种子萌发的差异表达基因初步研究。为了更好地了解朝仓花椒生理生化各方面的分子调控机制，实验室前期通过测序，成功构建了朝仓花椒的转录组数据库，并对朝仓花椒的转录组数据进行了初步的生物信息学分析[17]，利用朝仓花椒转录组数据库提供的序列信息设计引物对朝仓花椒几丁质酶基因进行克隆分析[18]，对朝仓花椒编码氨基酸基因序列进行密码子偏好性分析[19]。在前期研究的基础上，本研究通过BLAST比对，成功从朝仓花椒转录组数据库中鉴定获得31个CBL基因，并对该基因家族的所有基因就其保守结构域、进化关系、亚组分类等方面进行生物信息学分析，以期为朝仓花椒品种培育以及对朝仓花椒生长发育调节机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转录组序列测定材料为树龄6年的朝仓花椒(采自贵州大学农业生物工程研究院种植基地)，采用E.Z.N.ATM Plant RNA提取试剂盒(O MEGA bio-tek Inc.,Norcross,GA,USA)进行总RNA提取并委托深圳华大基因公司进行转录组测序。

1.2 试验方法

1.2.1朝仓花椒CBL基因家族的鉴定

通过NCBI BLAST分析，去除重复，从朝仓花椒转录组中鉴定获得31条ZpCBL家族的编码基因序列。

1.2.2朝仓花椒CBL蛋白基本性质鉴定

鉴定出朝仓花椒CBL基因家族成员后利用在线软件ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)对所有朝仓花椒CBL蛋白氨基酸序列进行分子质量、等电点、不稳定系数、亲疏水性预测[20]。

1.2.3朝仓花椒CBL基因家族进化关系分析

为探究朝仓花椒CBL基因家族进化关系，从相应网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下载拟南芥、橙子、杨树的CBL蛋白氨基酸序列与朝仓花椒CBL蛋白序列进行了一个合并的系统进化分析，利用MEGA软件，采用邻接法 (Neighbor-Joining)，构建系统进化树[21]。

1.2.4朝仓花椒CBL蛋白高级结构预测分析

使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)在线工具对蛋白二级结构进行预测[22]、使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在线软件对蛋白质三级结构进行预测[23]。

1.2.5朝仓花椒CBL家族蛋白多序列对比和保守基序分析

使用DNAMAN序列分析软件对筛选得到的31条朝仓花椒的CBL氨基酸序列进行多序列比对。在线分析软件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)定位各条ZpCBL蛋白序列的保守基序。

2 结果与分析

2.1 朝仓花椒CBL基因家族的鉴定

利用生物信息学方法，从朝仓花椒转录组中鉴定获得31条CBL家族的编码基因序列, 将其命名为ZpCBL1～ZpCBL31(表1)。通过ProtParam在线工具，对朝仓花椒CBL基因家族进行理化性质分析，结果显示，31条ZpCBL基因编码长度范围为108～858 bp，其中ZpCBL27的序列最短，为108 bp,近编码35个氨基酸，其编码蛋白质的相对分子量大小仅3.98 kDa，而ZpCBL5的序列最长，为858 bp, 共编码285个氨基酸，其编码蛋白分子量为32.92 kDa。理化性质分析结果显示，ZpCBL家族蛋白质的等电点范围在4.32～5.03之间，整体偏酸性。其中共19条ZpCBL蛋白不稳定系数大于40，为不稳定蛋白。ZpCBL蛋白中，除ZpCBL 1、ZpCBL 9、ZpCBL 10及ZpCBL 27为疏水蛋白外，其余均为亲水蛋白。

表1 朝仓花椒CBL基因家族基本性质

2.2 朝仓花椒CBL 蛋白进化关系分析

为深入分析与其他物种的同源进化关系，构建了朝仓花椒、拟南芥、杨树、橙子的CBL基因蛋白系统进化树，结果显示，65个CBLs蛋白根据进化树的分枝，可分为4个组(Ⅰ～Ⅳ)，Ⅰ组16个：ZpCBL 3、ZpCBL 9、ZpCBL 10、ZpCBL 16、ZpCBL 17、ZpCBL 18、ZpCBL 19、ZpCBL 20、ZpCBL 21、ZpCBL 22、ZpCBL 24、ZpCBL 25、ZpCBL 27、ZpCBL 28、ZpCBL 30、ZpCBL 31；Ⅱ组8个：ZpCBL 4、ZpCBL 5、ZpCBL 6、ZpCB 7、ZpCBL 13、ZpCBL 23、ZpCBL 26、ZpCBL 29；Ⅲ组5个：ZpCBL 1、ZpCBL 2、ZpCBL 11、ZpCBL 12、ZpCBL 15；Ⅳ组2个成员：ZpCBL 14、ZpCBL 8(图1)。

注：拟南芥(Arabidopsis thaliana)：AtCBL 1～13；橙子(Citrus sinensis)：CsCBL 1～8；杨树(Populus trichocarpa)：PtCBL 1～13。图1 植物CBL蛋白进化树

2.3 朝仓花椒CBL蛋白高级结构预测分析

为进一步研究ZpCBL蛋白空间结构上的相似性，对ZpCBL家族蛋白进行二级结构预测(表2)。ZpCBL蛋白α螺旋比例较高，在36.07%～62.50%之间，β折叠比例为3.28%～10.14%，延伸链比例为3.41%～19.80%，无规则卷曲比例在21.78%～47.54%之间。对ZpCBL蛋白三级结构进行分析，发现各蛋白三级结构相似(图2)。对空间结构的分析发现ZpCBL蛋白为多链折叠蛋白，以α螺旋为主。

2.4 朝仓CBL家族蛋白多序列对比

利用DNAMAN软件对筛选得到的31条朝仓花椒CBL蛋白序列进行多序列比对，发现朝仓花椒CBL家族EF-hand结构域具有较高保守性，多个氨基酸位点保守不变(图3)。

2.5 朝仓花椒CBL家族蛋白结保守基序分析

使用在线软件MEME对保守基序进行预测分析，再一次证明了EF-hand结构域是高度保守的。其中超过一半以上的氨基酸保守结构域序列拥有6种保守基序(图4)。

3 讨论

钙调磷酸酶B类似蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)是植物所特有的一类钙信号感受器，其通过结Ca2+被激活后以磷酸化的方式激活下游的钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases，CIPKs)，激活的CIPKs迅速通过磷酸化下游信号分子传递钙离子信号[24]。在高等植物中，参与特定的信号转导、感受并响应钙浓度变化是CBL蛋白家族作为Ca2+传感蛋白的基本功能。近年来，随着测序技术和生物信息学分析技术的进一步完善，基于转录组或基因组数据进行基因家族鉴定的报道日益增多，张杰伟等研究发现，桃基因组中的8个CBL家族基因，分布于桃的5条染色体上[24]。桃PpCBLs均含有保守的EF结构域，可分为4个亚家族。桃PpCBLs存在着大量的丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸潜在磷酸化位点；PpCBL 2、PpCBL 3和PpCBL 5均含有1个N-豆蔻酰化位点；PpCBL 1含有1个跨膜区[24]。刘淑梅等[25]从番茄基因组中鉴定出13个CBL基因，结果发现，番茄CBL基因在基因组中的分布是不均匀的，外显子数大多为8或者9，编码区序列大小在561～774 bp之间，但未对朝仓花椒CBL基因家族进行鉴定。本研究鉴定朝仓花椒CBL基因家族含有31个成员，并分别命名为ZpCBL1-31。EF-hand结构域是CBL蛋白的典型结构域。Kolukisaoglu等研究表明，不同的CBL蛋白的EF-hand结构发生不同程度的变异，但在所有已知的CBL蛋白中，EF-hand结构域的个数以及它们之间的距离是保持不变的[13]。结构域分析表明，31个朝仓花椒ZpCBL都含有4个EF-hand结构域，它们之间的距离非常保守，随着各个EF-hand结构域的分离以及生物学功能的解析，进一步丰富人们对植物CBL生物学功能的认识。对ZpCBL基因家族进行分析发现，朝仓花椒与拟南芥、橙子、杨树CBL蛋白在各亚家族之间均有成员分布。ZpCBL基因家族在进化上可分为4组，第Ⅰ组16个、第Ⅱ组8个、第Ⅲ组5个、第Ⅳ组2个成员，根据彭昭雯[26]研究的CBL基因家族分类可知，第Ⅰ组属于第一亚家族和第二亚家族，第Ⅱ组属于第一亚家族，第Ⅲ组属于三四亚家族，第Ⅳ组属于第二亚家族。第二亚家族中拟南芥AtCBL 1与AtCBL 9序列一致性高达89.00%，但是其功能却存在异同，表明有一定功能冗余[27,28], 拟南芥AtCBL1能被高盐、干旱、低温和伤害等非生物胁迫强烈诱导，但不受外源ABA胁迫的影响[29]，而拟南芥AtCBL9则能被ABA胁迫诱导表达[28]；推测第Ⅳ组中的ZpCBL14、ZpCBL8基因可能响应高盐、干旱、低温等胁迫诱导，但其具体响应何种胁迫还需要进一步研究其在植物体内功能。本研究以朝仓花椒转录组数据库为基础，利用生物信息学方法对ZpCBL基因家族进行了初步的分析鉴定，为进一步研究ZpCBL基因蛋白结构与功能之间的关系以及作用机理提供重要依据。