WentilactoneA 的遗传毒性评价

侍雯婧，田逸君，黄才国，朱玉平，严 朗，郑怡文 （海军军医大学：. 海军医学系卫生毒理学教研室；. 基础医学院生物化学与分子生物学教研室，上海 200433）

Wentilactone A（WA）是从海洋微生物中分离得到的去甲二萜类小分子化合物，对小细胞肺癌细胞系NCI-H460 和NCI-H446 细胞的增殖具有抑制作用，可诱导小细胞肺癌细胞系NCIH446 和NCT-H1688 细胞凋亡[1]。对小细胞肺癌细胞系NCT-H1688 细胞的细胞迁移和集落形成具有抑制作用[2]。WA 作为一种有效抗肿瘤候选物，已从制备工艺、理化性质、急性毒性、生殖毒性等方面证明其良好的成药性[3]。遗传毒性安全性实验更是对其临床前研究全面性的补充，为提高临床用药的安全性，为了验证其是否具有遗传毒性，本实验应用微生物回复突变试验（Ames 试验）、体外培养CHO 细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验方法对WA 的遗传毒性进行了系统的研究，为WA 的临床前毒性评价提供资料[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 化合物WA

Ames 试验用 WA（含量：99.9%，批号：20121115，黄色粉末）、体外培养CHO 细胞染色体畸变试验用（规格：10 ml，含量：50.8 mg/ml，批号：20130506，黄色澄明溶液）、小鼠骨髓微核试验用WA（规格：10 ml/支：100mg，含量：10.2 mg/ml，批号：20130407，黄色澄明溶液），均由海军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室提供。WA 的化学结构见图1。

图1 WentilactoneA 的结构式

1.1.2 菌株

组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌（S. typhimurium）TA97、TA98、TA100、TA102 和 TA1535 共 5 支菌株，复旦大学公共卫生学院环境卫生教研室赠予。实验前对其进行鉴定（R 因子和自发回变数鉴定），均符合规定标准。

1.1.3 细胞

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞由复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予。

1.1.4 动物

ICR 小鼠（SPF 级）共 60 只，每组 10 只，雌雄各半，5～6 周龄，购入时体重 16.5～20.8 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物质量合格证号：2008001629237。自购入起3 天进行检疫，给药时体重20.3～23.6 g。

1.2 试验方法

按《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》[5-6]的设计要求，分别应用Ames 试验[7]、体外培养CHO 细胞染色体畸变试验[8]和小鼠骨髓微核试验[9]检测WA 的遗传毒性。检测终点覆盖了基因突变、染色体畸变和细胞有丝分裂异常。

1.3 实验步骤

1.3.1 Ames 实验

根据《药物遗传毒性研究技术指导原则》的要求，应用S. typhimurium TA97、TA98、TA100、TA102和 TA1535 共 5 支菌株，设每皿 5 000、500、50、5、0.5 μg 5 个剂量组。此外，设空白对照、溶剂对照和阳性对照组（具体剂量见表1）。采用标准平板掺入法，使细菌在加和不加代谢活化系统S9 的条件下接触受试物，每皿均加入供试品或溶剂对照DMSO 0.1 ml，每个剂量组及对照组均设3 个平行皿。并用最低极限的琼脂培养基培养48 h 后，先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况，确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用，再人工计数每皿回复突变的菌落数，记录原始数据，并计算每组的均值和标准差，与溶剂对照组进行比较，重复实验一次。

表1 阳性对照品名称及浓度

1.3.2 染色体畸变试验

在加和不加代谢活化系统S9 的条件下，体外培养的CHO 细胞中加入相应浓度的供试品或对照品，反应体系总体积为10 ml。低、中、高剂量组供试品终浓度分别为 23.74、47.48 和 94.96 μg/ml，阳性对照组丝裂霉素C 和环磷酰胺的终浓度分别为0.5 μg/ml、60 μg/ml，另设溶剂对照组分别作用于细胞4 h 后换液继续培养至24 h，和药物作用细胞24 h后收集细胞。收获细胞前4 h，加入终浓度0.2 μg/ml秋水仙素，培养结束收集细胞，经离心、低渗处理、固定、离心、制片和Giemsa 染色，每个剂量组制备2～3 张玻片标本。

镜检时每组观察200 个染色体中分散良好、数目完整的中期分裂相细胞（若观察到大量染色体畸变细胞，如阳性对照组，分析细胞数可相应减少为至少100 个细胞）。计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目（裂隙和核内复制一般不作为畸变类型），记录原始数据计算畸变率。

1.3.3 小鼠骨髓微核实验

检疫期结束后分别按低、中、高组小鼠给药，分别予100、200、400 mg/kg 剂量给药，其中高剂量组设两组分别在药物作用24 h 和48 h 后处死，并设阳性对照组和溶剂对照组。分别在药物作用24 h和48 h 后处死小鼠，取股骨骨髓制成骨髓涂片，每只动物制2 张涂片，经甲醇固定后用pH6.8 的Giemsa 染液染色。

每只动物镜检约2000 个骨髓嗜多染红细胞（PCE），计数含微核的 PCE 数（MNPCE），计算微核发生率，同时记录200 个PCE 计数过程中观察到的正染红细胞（NCE）的数目，并计算PCE/NCE 值。

1.4 剂量设计

对于易溶无毒的化合物，细菌实验最高浓度应达到 5 mg/皿[10]。Ames 试验设每皿 5 000、500、50、5、0.5 μg 5 个剂量组，每皿均加入相应浓度的供试品溶液0.1 ml，另设空白对照、溶剂对照和阳性对照。在哺乳动物细胞体外遗传实验中，毒性水平应高于50%细胞抑制率或细胞融合率[11]。通过预实验确定供试品的IC50为94.96 μg/ml。染色体畸变试验的低、中、高剂量组为23.74、47.48 和94.96 μg/ml，试验时在 10 ml 的试验体系中分别加入0.1 ml 各剂量组的应用液，另设阳性对照组和溶剂对照。ICR 小鼠的微核试验采用小鼠经尾静脉注射给药，总剂量分别为100、200、400 mg/kg（单次给药剂量分别为50、100、200 mg/kg，分上、下午两次经尾静脉注射给药），给药容积为20 ml/kg 体重；同时设阳性对照组和溶剂对照组。阳性对照组以40 mg/kg 体重的剂量腹腔注射环磷酰胺，给药容量为10 ml/kg 体重；溶剂对照组给药方式与受试物组相同，以20 ml/kg 体重的容积经尾静脉注射生理盐水。

1.5 统计方法

Ames 试验结果的评价是以溶剂对照组的回复突变菌落数为基础，与受试物各剂量组相比较。若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组的2 倍以上，呈现可重复性，并在一定的剂量范围内存在着剂量-反应关系，则判断为阳性[12]。染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验均采用卡方检验或方差分析方法研究给药组与对照组之间是否具有统计学意义[13]。

2 结果与分析

2.1 Ames 试验结果

受试物各剂量组和对照组的平皿均可见背景菌苔生长。5 支菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在历史参考范围内，并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落与空白对照组相比数目显著增加，提示本试验系统符合要求。在最高剂量已达到5 000 μg/皿的受试条件下，未观察到受试物的抑菌现象。各剂量组受试物 在 加 或 不 加S9 时 对TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 所诱发的回复突变菌落数均与自发的突变菌落数相近，未观察到明显的剂量-反应关系。结果见表2 和表3。

2.2 染色体畸变试验结果

染色体分析结果显示，阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高，24 h 在+ S9 和－S9 的情况下染色体畸变率分别为11% 和11%，与溶剂对照组相比，均有统计学差异（P＜0.05）；23.74、47.48 和 94.96 μg/ml 受试物在 24 h、+S9 条件下染色体畸变率分别为1%、1% 和0.5%，24 h、－S9 条件下染色体畸变率分别为0%、0.5%和0%；4 h、－S9 条件下染色体畸变率分别为0%、0%和0%。综上，受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5%，与溶剂对照组结果相比，其差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表 4～6。

表2 WA 对 5 支菌株的回变菌落数试验结果 (个/皿，s)（第 1 次）

表2 WA 对 5 支菌株的回变菌落数试验结果 (个/皿，s)（第 1 次）

组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 5 000 36±5 40±4 21±3 21±2 131±26 93±17 177±21 185±25 25±3 14±2 500 36±5 39±8 17±4 20±3 114±22 90±23 195±8 207±7 23±1 19±1 50 39±10 35±5 21±7 21±3 115±21 97±8 196±33 179±18 19±8 16±4 5 41±6 40±3 21±5 22±4 114±15 87±19 195±21 193±8 19±2 14±1 0.5 37±6 39±3 20±3 19±3 128±15 91±12 201±14 205±14 20±6 16±4空白对照组 40±7 36±5 17±2 19±4 99±17 89±9 213±30 197±34 21±7 19±4溶剂对照组 40±6 34±1 22±5 26±2 95±8 89±9 193±8 199±29 23±3 14±1阳性对照组 839±24 841±47 936±56 1 077±55 968±27 1 111±66 1 101±17 1 024±53 342±44 345±13

2.3 小鼠骨髓微核试验的结果

试验结果经统计学分析表明，WA 在100、200、400 mg/kg 剂量下未观察到对小鼠骨髓的抑制作用，溶媒对照组和阳性对照组雌、雄性小鼠骨髓PCE 微核发生率分别为2.10‰和21.36‰、1.90‰和20.88‰，两组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），验证了本次试验系统的有效性。WA 100 和2 000 mg/kg 剂量24 h 采样组雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分别为1.60‰和1.80‰、1.90‰和1.60‰；400 mg/kg 剂量24 h 和48 h 采样组雌、雄小鼠骨髓PCE 微核率分别为2.10‰和2.80‰、2.40‰和1.29‰，与溶媒对照组相比均无显著差异（P＞0.05）。结果见表7。

3 讨论

沙门菌回复突变试验（Ames 试验）被研究者广为采用，该法的特点是快速、简便、敏感、经济，是经典的测试化学物质或药物致突变性实验[10]。染色体畸变分析是采用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞体外培养的方法进行的。CHO 细胞在加或不加代谢活化系统的条件下，与受试物接触一定时间后再于收集染色体4 h 前用秋水仙碱处理，使细胞的有丝分裂停止在中期相。然后收集细胞，经低渗、固定、涂片和染色后，在显微镜下观察染色体数量和结构的改变，检测受试物的诱变性[7]。微核试验是检测化合物对染色体损伤作用的重要方法。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化合物，微核试验都可检测[8]。

表3 WA 对 5 支菌株的回变菌落数试验结果 (个/皿，s)（第 2 次）

表3 WA 对 5 支菌株的回变菌落数试验结果 (个/皿，s)（第 2 次）

组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S9－S9 5 000 38±5 34±5 20±5 21±5 128±24 105±26 179±21 189±19 20±4 20±3 500 39±7 34±3 21±2 20±7 108±13 92±28 192±16 187±30 16±3 19±4 50 38±9 30±3 19±3 18±1 117±14 102±5 197±5 196±22 17±3 18±1 5 37±8 29±4 18±2 17±1 111±5 98±33 206±24 191±21 16±1 20±2 0.5 35±6 33±8 24±2 23±3 107±7 97±8 203±6 193±10 15±4 15±4空白对照组 38±3 41±4 22±3 23±4 96±12 93±8 205±17 186±19 18±2 18±4溶剂对照组 38±3 37±8 22±3 23±4 98±7 100±12 202±15 197±10 18±2 19±4阳性对照组 881±18 876±35 900±11 1 077±111 964±113 996±8 1 024±37 1 011±8 392±8 392±22

表4 WA 对 24h 体外培养 CHO 细胞的染色体畸变试验结果 (+S9)

表5 WA 对 24h 体外培养 CHO 细胞的染色体畸变试验结果 (－S9)

表6 WA 对 4h 体外培养 CHO 细胞的染色体畸变试验结果 (－S9/4h)

表7 WA 对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核效应试验结果

本研究采用遗传毒性研究经典组合的方法，分别从原核系统到真核系统，从体外试验系统到体内试验系统，体外试验中包含了加与不加代谢活化系统，能检测基因突变、染色体畸变等多个遗传学终点，符合国际标准化的要求[5-6]。

本研究结果显示，本试验条件下，采用标准平板掺入法，WA 在每皿 5 000、500、50、5、0.5 μg 的受试剂量下，加或不加S9 时对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌均无致突变性；对CHO 细胞，在23.74、47.48、94.96 μg/ml 3 个剂量组，加或不加 S9，于 24 h和48 h 诱发的细胞染色体畸变率均小于5%，与溶剂对照组结果相比较其差异均无统计学意义（P＞0.05），表明 WA 在受试剂量下无致 CHO 细胞染色体畸变效应；WA 在 100、200、400 mg/kg 3 个剂量下，对ICR小鼠的微核诱发率与溶剂对照组比较均无显著差异，表明其在受试剂量下对ICR 小鼠无致微核效应[14]。上述结果提示WA 没有遗传毒性和潜在致癌性。

此前有文献表明WA 对小细胞肺癌的增殖有抑制作用，但对于遗传毒性未见报道。本研究对降低WA 在研发过程中用于临床试验和疾病治疗的用药风险发挥重要作用。