二维液相色谱法测定脑脊液中替加环素浓度及其临床应用

程彩奕，邓冬梅，王显凤，杨 征，幸海燕 （陆军军医大学大坪医院药剂科，重庆 400042）

颅内感染尤其是多重耐药菌感染具有进展快、反应重、治疗难度大、病死率高的特点，故提高颅内感染治愈率受到患者及临床的广泛关注。替加环素（TGC）作为首个甘氨酰四环素类抗菌药物，具有抗菌谱广、抗耐药活性强的特点，对临床上常见耐药菌（如鲍曼不动杆菌、产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等）均有较好的疗效[1]。在耐药菌治疗药物不足的情况下，临床医生将TGC 用于颅内感染的治疗，此外，越来越多的案例报道称，TGC 可有效清除致病菌[2-3]。

TGC 成功治疗颅内感染与脑脊液中有效药物浓度密切相关，TGC 浓度监测对于提高颅内感染治愈率、精准指导临床合理用药具有重要意义[4]。本研究将利用二维液相色谱高效的自动化在线样品处理能力，建立脑脊液中TGC 浓度测定方法。该方法与已报道的质谱法相比，具有操作简便、成本低、抗干扰能力强、基质效应小等优势，脑脊液样品无需复杂的前处理，高速离心后直接进样，短时间内即可完成萃取、转移及分析，更易于临床推广应用。

1 仪器与试药

1.1 仪器

二维高效液相色谱由FLC-2 701 全自动二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司）和LC-20A 色谱模块（日本岛津公司）构成；-80 ℃冰箱（美国赛默飞科技公司）；十万分之一电子天平（德国赛多利斯仪器公司）；涡旋混匀器（美国SI 仪器公司）；低温高速离心机（美国贝克曼仪器公司）。

1.2 药品与试剂

TGC 对照品（北京百灵威科技公司，批号: 10-MWV-62-1）；乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯；高氯酸、氨水为分析纯；超纯水自制。

1.3 空白脑脊液

入住神经外科且未使用TGC 的患者，住院期间需开展脑脊液生化检查时留取或从留置腰大池/脑室引流管中适量抽取。

2 方法与结果

2.1 标准溶液的配制

精密称取TGC 对照品1.29 mg，用20 mg/ml 精氨酸水溶液定容至100 ml 容量瓶中，即得12.90 μg/ml的TGC 标准溶液。

2.2 样品前处理

预处理方法考察时，取脑脊液样品500 μl，直接离心、分别加入3 倍体积甲醇、乙腈、10%高氯酸沉淀蛋白，涡旋混匀5 min，13 000 r/min 离心10 min，取上清液进样分析。最终确定预处理方法为: 脑脊液样品13 000 r/min 离心10 min 后直接进样，采用外标法定量分析。

2.3 色谱条件

第一维色谱柱LC1 为Aston SNX5 苯基色谱柱（50 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为磷酸铵（氨水调 pH7.5）-甲醇 (45∶55，V/V），第二维色谱柱 LC2为 Aston SC5 C18色谱柱（275 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为磷酸铵（氨水调pH7.4）-磷酸铵（氨水调pH3.0）-乙腈（30∶50∶20，V/V/V），辅助流动相为纯化水。检测波长340 nm，色谱柱温40 ℃，进样量：200 μl，工作原理图见图 1，时间程序见表 1。

图1 二维液相工作原理示意图

表1 TGC 检测时间程序

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性

分别制备空白脑脊液样品、含TGC 的标准脑脊液样品、患者用药后的脑脊液样品，进行二维液相分析，得到色图谱，观察有无内源性干扰，如图2所示。结果表明，TGC 的出峰时间9.38 min，脑脊液的内源性成分对TGC 的测定无干扰。

图2 脑脊液中 TGC 色谱图

2.4.2 线性关系

取不同体积TGC 标准溶液，加入空白脑脊液定容，配制成浓度为64.5、129.0、387.0、645.0、1 290.0 ng/ml 的系列对照溶液，按“2.2”项下操作后进样分析。以TGC 浓度为自变量（X），脑脊液中TGC 的峰面积为因变量（Y）进行线性回归，得回归方程为：Y=116.32X-3 223.6（r=0.999 8）。结果表明TGC 浓度在64.5～1 290.0 ng/ml 范围内线性关系良好，最低定量限为64.5 ng/ml。

2.4.3 精密度与准确度

分别配制含TGC 低、中、高及定量下限（225.0、450.0、900.0、64.5 ng/ml）4 个浓度的质控（QC）脑脊液样本，按“2.2”项下操作后进样分析。1 d 内每个浓度平行测定5 份QC 样品，连续测定3 d。将测得的峰面积代入“2.4.2”项下，计算各质控样品的浓度，并根据样本实际浓度计算本法的精密度与准确度。结果如表2 所示，日内、日间RSD 均小于5%，准确度均在98.80%～106.51%之间。可见本实验所建立的二维液相色谱法测定脑脊液中TGC 的精密度和准确度符合《中国药典》（2015 年版）检测要求[5]。

表2 脑脊液中测定 TGC 浓度的精密度与准确度 (%)

2.4.4 稳定性

配制“2.4.3”项下低、中、高及定量下限4 个浓度的QC 样品，每个浓度平行3 份，分别考察室温放置4 h、进样器放置6 h、反复冻融3 次、冰冻放置1 周后的稳定性。结果如表3 所示，表明上述条件对TGC 的检测结果无明显影响。

2.5 临床应用

本实验选取2 例接受TGC 治疗的多重耐药菌所致的重症颅内感染患者，脑脊液标本药敏试验均报告对TGC 敏感。患者1 接受说明书推荐剂量，即首剂静脉滴注100 mg，后以50 mg 每12 h 维持治疗。患者2 同样接受静脉给药，剂量为受试者1 的2 倍。达到稳定药物浓度后，留取两位受试者的脑脊液，按“2.2”项下操作后进样分析。受试者脑脊液中TGC 浓度分别为187.42、275.41 ng/ml。

3 讨论

3.1 蛋白沉淀剂的选择

甲醇、乙腈、10% 高氯酸是常用蛋白沉淀剂，本研究在空白脑脊液中分别加入3 倍体积上述沉淀剂，离心后与不加蛋白沉淀剂组比较，沉淀量无显著差异，且所得上清液与沉淀完全分离。现多项研究认为，因脑脊液中蛋白质含量低，故直接离心更利于生物样品的微量分析[6]。另直接离心法进样，脑脊液中TGC 浓度无稀释，也无其他前处理方法造成的误差，更利于临床样本的分析。

3.2 临床应用

TGC 对G-菌（如流感嗜血杆菌、大肠杆菌、对鲍曼不动杆菌等）MIC90为2～4 mg/L[7-8]。本试验中，无论是常规给药还是加倍剂量给药的患者，稳态脑脊液浓度显然均未起到杀菌作用，导致抗感染治疗效果不佳。这可能与以下因素有关：①TGC相对分子质量大而且水溶性强，很难进入到脑脊液中。有研究报道在血脑屏障正常的志愿者中，脑脊液中TGC 浓度仅为血浆的11%。而对于脑膜炎患者，血脑屏障通透性可增至33%～52%，这可能也是静脉注射TGC 成功治疗颅内感染的主要原因[9-10]，但血脑屏障破坏的程度个体差异较大。②重症感染患者常伴有全身炎症反应、肝肾功能异常、多器官功能障碍综合征等，血药浓度低于正常水平，在同等穿透率的情况下，药物从血液进入脑脊液中的剂量减少[11]。③TGC 的蛋白结合率较高，为71%～87%[12]。颅内感染时，脑脊液蛋白水平提高，使游离的药物浓度降低[13]。④ 脑脊液引流量与药物清除率呈正相关，引流量越大，脑脊液中的药物浓度越低[14]。

表3 脑脊液中 TGC 在不同温度条件下的稳定性

目前，TGC 治疗方案大多参照说明书或文献报道推荐剂量，未考虑血脑屏障、脑脊液引流量、给药途径等患者自身因素的影响，使颅内TGC 的浓度不足、疗效不佳。本研究建立的脑脊液中抗菌药物TGC 的二维液相色谱分析方法简便、准确、稳定，对促进TGC 的合理使用、改善临床治疗结局具有重要意义。临床可根据脑脊液中TGC 的浓度，及时调整给药剂量或给药途径，提高治愈率，节省医疗费用。此外，也为研究TGC 在颅内的药动学及量效关系奠定了基础。