基于网络药理学和分子对接的荆防败毒散预防新型冠状病毒肺炎的活性成分研究

冯 群，关永霞，黄志艳，叶士莉，程国良，姚景春,3，张贵民,3 （1. 鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂76006；. 鲁南制药集团股份有限公司，中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 76006；3. 山东新时代药业有限公司，山东 临沂 73400）

2019 年12 月，武汉市出现多例不明原因的病毒性肺炎病例，病例临床表现主要为发热、咳嗽，少数病人腹泻、呕吐、呼吸困难，胸片呈双肺浸润性病灶[1]。2020 年2 月11 日，世界卫生组织将该病命名为新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），并称引起该病的病毒为SARSCoV-2，与成年人相比，儿童更不易感染该病毒，65 岁以上老年人更易受感染[2]。目前全球疫情愈演愈烈，国内用了两个多月控制住疫情，中医药做出了巨大贡献，但部分地区输入性病例和无症状感染者不断增加，寻找相应的群体性配方，是当前一项十分紧迫的研究任务。据古文献记载，加上黄煌教授临床经验和近期的个案报道，建议可以采用两首古代相传的治疗时令病的经验成方——荆防败毒散和十神汤，作为群体性预防用方[3]。

荆防败毒散，出自《摄生众妙方》，由荆芥、防风、羌活、独活、柴胡、前胡、川芎、枳壳、茯苓、桔梗、甘草等十一味中药组成，已上市的中成药包括荆防颗粒、荆防合剂。临床研究表明，荆防败毒散能缓解发热、咳嗽、喘息与肺部啰音等作用，调节机体炎症因子和细胞免疫状况，增强机体的免疫功能[4-6]。现代药理学研究证明其具有解热、镇痛和抗炎的作用[7]。

本文通过网络药理学筛选出荆防败毒散作用靶点，并进行聚类分析，预测荆防败毒散中核心活性成分，进而运用分析软件对药材-成分-靶点进行分子对接及信号通路分析，并预测其治疗COVID-19 的作用机制，为荆防败毒散用于预防及治疗COVID-19 的可能性提供理论参考。

1 方法

1.1 荆防败毒散成分的检索与筛选

借助中药系统药理分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[8]，分别以荆芥、防风、羌活、独活、柴胡、前胡、川芎、枳壳、茯苓、桔梗、甘草为关键词搜索荆防败毒散中的成分。本研究结合口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18），筛选收集到的化学成分，并结合《中国药典》2015 年版中药物的含量测定项对已筛选的成分进行补充，最终建立荆防败毒散的成分库。

1.2 靶标蛋白的筛选和成分-靶点网络构建

经OB 和DL 筛选合格的成分，在TCMSP 数据库对其成分靶点进行收录。对未在TCMSP 中收录靶点的成分，在PubChem 查询成分对应的Canonical SMILES 序列，并利用此序列在Swiss Target 数 据 库[9]（http://www.swisstargetprediction.ch/）中对该成分的靶点进行预测，收集预测结果中的靶标蛋白基因名称。最后对收集的所有靶点在Unitprot 数据库[10]（http://www.Unitprot.org/）输入蛋白名称并限定来源为Homo sapiens，获取官方基因名作为荆防败毒散的靶点库。通过Cytoscape 3.6.1 软件，构建荆防败毒散药材-成分-靶点网络，分析成分和靶点网络。

1.3 COVID-19 靶点获取

在CTD、NCBI 和GeneCards 数据库中，以“COVID-19”、“novel coronavirus pneumonia”等检索词检索，检索时间为2020 年7 月13 日。将检索结果合并、去重，获取新冠肺炎疾病相关基因，并把相关基因编码的蛋白质作为药物治疗的潜在作用靶点。

1.4 PPI 网络构建

将荆防败毒散成分的靶点与COVID-19 靶点分别导入String 数据库，获取荆防败毒散成分靶点和COVID-19 靶点的蛋白-蛋白相互作用（PPI）关系，通过Cytoscape 软件Merge 功能，取两者交集，挖掘关键靶点网络。

1.5 靶点的通路分析

为了进一步了解上述筛选出的靶标蛋白基因的功能及在信号通路中的作用，将筛选得到的作用靶点导入 Metascape 数据库[11]（https://metascape.org/），通过输入靶基因名称列表并限定物种为人，进行 GO（gene ontology）生物过程（BP，Biological Process）、细胞组成（CC，cellular component）、分子功能（MF，molecular function）富集分析和 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信号通路富集分析，并利用R 4.0.0 软件将其结果可视化。

1.6 成分-靶点分子对接

从 ZINC 数据库[12]（http://zinc.docking.org/）下载Degree 值前10 成分的mol2 格式文件，用Autodock Tool 软件打开该成分，使其能量最小化并判定成分的Root、选定可扭转的键，保存为*pdbqt 格式文件。从 PDB 数据库[13]（https://www.rcsb.org/）下载 SARS-CoV-2 3CL 水解酶（Mpro，PDB ID: 6LU7）和血管紧张素转化酶 II（ACE2，PDB ID:1R42）的 3D 结构 PDB 格式文件[14-15]，运用 Pymol软件移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子（如水分子），再保存为PDB 格式文件。随后用Autodock Tool 软件打开的PDB 文件，加氢、计算电荷并给蛋白添加原子类型（Assign AD4 type），将其保存为*pdbqt 格式文件[16]。

运用Autodock Vina 将成分和受体对接。结合能小于0 说明配体与受体可以自发结合，目前对于活性分子的靶点筛选尚无统一标准，本文根据结合能进行排序，结合能数值的绝对值越大，对接结果较好，该成分可视为荆防败毒散预防COVID-19 的潜在活性成分。

2 结果

2.1 活性成分的筛选

从TCMSP 数据库中搜索荆防败毒散各味药的成分，并依据OB≥30%及DL≥0.18 要求，得到最终选定的结果为187 个不同的成分（28 个无已知靶点），其中荆芥11 个、防风18 个、羌活15 个、独活9 个、柴胡17 个、前胡24 个、川芎7 个、枳壳5 个、茯苓15 个、桔梗7 个、甘草92 个。筛选后的荆防败毒散中部分活性成分的基本信息见表1。

2.2 药材-成分-靶点相互作用网络

利用Cytoscape 软件进行“荆防败毒散药材-成分-靶点”网络的构建，网络共包括447 个节点（11 种药材节点、159 个成分节点、277 个靶点节点）和2 718 条边，如图1 所示，其中形状“△”代表药材，“〇”代表成分，“◇”代表基因，每条边则表示药材中所含成分及成分与靶点相互作用关系。性状的大小代表Degree 值的大小。按照Degree值，排名前10 位的成分分别是槲皮素、山奈酚、木樨草素、汉黄芩素、β-谷甾醇、7-甲氧基-2 甲基异黄酮、丹参酮IIA、柚皮素、芒柄花黄素、异鼠李素。

2.3 PPI 网络构建

在数据库中检索并筛选得到COVID-19 相关的273 个靶点，将273 个疾病靶点和277 个荆防败毒散活性成分的作用靶点导入String 数据库，得到靶点PPI 关系，利用Cytoscape 软件将两者进行Merge 取交集处理，得到包含55 个靶点和766 条边的Hub 网络，见图2。按照Degree 值从高到低，Hub 网络中排名前10 位的靶点分别为MAPK3、TNF、IL6 、CASP3 、TP53 、MAPK8 、MAPK1、IL10、CCL2、MAPK14。

表1 荆防败毒散中部分活性成分的基本信息

图1 荆防败毒散药材-成分-靶点网络

图2 荆防败毒散干预 COVID-19 的 Hub 网络

2.4 GO 功能分析和KEGG 通路分析

通过Metascape 数据库进行的GO 功能富集分析得到GO条目1 376个（P＜0.01），其中BP条目1 304个，包括细胞因子和凋亡信号、刺激反应、多生物过程、免疫过程、细胞代谢、生物进程调控等；CC 条目19 个，包括细胞膜、细胞器膜、基质、转录因子等；MF 条目53 个，包括酶活性和酶结合、细胞因子活性和结合能力、转录因子结合、蛋白特异性结合等各类别分析中排名前20 位的条目，见图3。

KEGG 通路富集分析筛选得到 136 条（P＜0.01）通路，涉及与寄生虫、真菌、病毒感染引起的疾病通路有22 条（如朊病毒、甲型流感、人类嗜T 淋巴细胞病毒I 型感染、丙肝、肺结核、疟疾、百日咳等）、癌症相关的通路17 条（如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、癌症中碳代谢、转录失调等）、细胞进程、免疫系统进程、信号通路等。选Count 值较大的前20 条通路进行可视化，结果见图4。

2.5 分子对接结果分析

将荆防败毒散中排序前10 的核心成分分别与Mpro、ACE2 受体进行分子对接。一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大，结合能≤-5.0 kJ/mol 作为筛选标准，结合能≤-20.93 kJ/mol 时则视为成分与靶点有较好的活性，结合能≤-29.336 kJ/mol 时则结合活性强烈[17]。分子对接结果显示，筛选出的荆防败毒散核心成分与Mpro 结合能远小于-20.93 kJ/mol，与ACE2 受体结合能远小于-29.336 kJ/mol（见表 2）。选择结合能均小于-29.336 kJ/mol 的β-谷甾醇、丹参酮IIA、芒柄花黄素，对其与Mpro、ACE2 的结合形式进行分析，丹参酮IIA 可与Mpro 的110 位谷氨酰胺（GLN）和 ACE2 的 158 位络氨酸（TYR）形成氢键（键长20 nm 和22 nm）；芒柄花黄素可与Mpro 的 131 位精氨酸（ARG）和 287 位亮氨酸（LEU）分别形成氢键（键长 27 nm 和 19 nm），与ACE2 的 615 位天冬氨酸（ASP）形成氢键（键长22 nm）。氢键、疏水作用可能是荆防败毒散成分与两个受体主要的结合形式，结果见图5。分子对接结果表明荆防败毒散中活性成分与Mpro、ACE2结合活性较强，与后者的结合能力优于前者。

图3 荆防败毒散成分作用靶点 GO 功能分析

图4 荆防败毒散核心靶点 KEGG 富集分析的前 20 条通路气泡图

表2 荆防败毒散中核心成分与 Mpro、ACE2 的结合能

3 讨论

突如其来的疫情给人类带来巨大挑战，人类必须努力了解疾病特点，尽快寻找到控制措施[18]。荆防败毒散，由人参败毒散去人参加荆芥、防风而成。以荆芥、防风，羌活、独活发汗解表，开泄皮毛，使风寒之邪随汗而解，为通治一身风寒湿邪的常用组合。柴胡、枳壳、桔梗调畅气机，川芎行血合营，羌活、茯苓化痰渗湿，三组合用，意在解表祛邪与疏通气血津液。甘草调和药性，祛风散寒之力较强，宜于外感风寒湿邪较重者。荆防败毒散治退热效果极佳，用于流行性感冒见效快[19-20]。新冠肺炎疫情属于寒湿疫。因此，基于辨证论治的原则，荆防败毒散可作为群体性预防用药的选择，并对初期轻症（寒湿证）的新冠肺炎有一定治疗效果。

根据KEGG 分析，得到136 条通路，包括感染性疾病通路、癌症通路、细胞进程通路、免疫系统通路、信号通路等。KEGG 前20 条通路中，频率最高的靶点为RELA、MAPK1、MAPK3、TNF、IL6。RELA 在调节对感染的免疫应答中起关键作用，而且其磷酸化调节作用可抑制肿瘤的发生[21]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。TNF 在抗肿瘤、抗感染、免疫、炎症等多种生理病理过程中发挥着关键的作用[22]。结果表明荆防败毒散呈现出中药多成分-多靶点-多途径协同作用的特点，通过对上述靶点的作用，调节感染类疾病通路、免疫损伤性、炎症通路，起到防治COVID-19 的作用。

图5 β-谷甾醇、丹参酮ⅡA、芒柄花黄素与 Mpro 和 ACE2 的分子对接图

ACE2 是 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的 宿 主细胞受体，SARS-CoV-2 通过表达的S-蛋白与人体ACE2 结合，导致病毒入侵而致病，这可作为治疗COVID-19 的突破口[23-24]。Mpro 是单正链 RNA 病毒前体多聚蛋白水解酶核心部分，将宿主细胞内的病毒RNA 翻译成蛋白以产生子代毒，在RNA 复制、逆转录过程中具有重要的作用[25-26]，抑制Mpro 活性将能阻止病毒的感染和复制。通过分子对接，这10 个成分与SARS-CoV-2 3CL 水解酶的结合能远小于-20.93 kJ/mol，与ACE2 受体的结合能远小于-29.336 kJ/mol，与二者结合最好的成分均为β-谷甾醇和丹参酮IIA，结合形式包括氢键、疏水作用。此外，槲皮素、山柰酚、异鼠李素也具有较强的结合能力[27-28]。表明荆防败毒散核心成分与COVID-19 相关蛋白有较强的结合能力。

基于上述研究，荆防败毒散对肺部疾病有一定的保护治疗作用，能提高机体免疫力，对COVID-19 具有潜在的防治作用，可作为群体性预防用药以及发病初期的治疗。鉴于网络药理学和分子对接的局限性，荆防败毒散防治COVID-19 的效果有待临床进一步验证。