运动对肥胖大鼠骨骼肌FGF21及其调控因子的影响

2020-12-04李良徐建方苏浩

中国运动医学杂志 2020年7期

李良徐建方苏浩

1 国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

2 北京体育大学（北京100084）

1 前言

肥胖的大规模流行已成为全球范围内严重的公共卫生问题之一。肥胖及与其相关的并发性疾病如高脂血症、心血管疾病等不仅严重危害人体的健康，还会加重社会和家庭的医疗负担。研究发现，规律的体育锻炼，无论是有氧运动、抗阻运动还是高强度间歇运动，都是减少脂肪堆积、控制体重的有效手段，并能为身体健康带来长久的益处[1]。

运动在健康促进中的作用得益于其诱导产生的多种代谢调节因子，它们加强了不同组织间的交互作用，进而调节了机体的代谢水平[2]。近些年来的研究发现，成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）也是运动诱导产生的代谢调节因子之一。FGF21是一种内源性代谢调节因子，在糖、脂代谢的调节中发挥重要作用[3]。FGF21 主要由肝脏分泌，在脂肪、心脏、骨骼肌等组织中均有表达，它必须借助辅助因子β-Klotho 的作用才能与受体完整结合，进而发挥生理调节作用。FGF21 在降低血糖水平、提高胰岛素敏感性、促进能量消耗等方面的作用已得到诸多研究的证实[3]。有研究发现，30 min的急性有氧运动提高了人体循环中的FGF21水平；在动物实验中，一次性的急性运动促进了小鼠肝脏FGF21 的基因表达，同时也提高了小鼠血清FGF21 水平[4]。但在长期运动干预实验中发现，36周的自由转轮运动降低了OLETF肥胖大鼠血清及肝脏FGF21 的表达水平，但FGF21 下游信号因子及β-Klotho 的表达水平却上升，该研究提示运动可能提高了FGF21 的敏感性，使其更好地发挥生理调节作用，改善了脂代谢水平[5]。我们在前期的研究中也发现，8周的有氧运动或抗阻运动干预虽然降低了肥胖大鼠血清及肝脏FGF21 的基因表达水平，也有效降低了肥胖大鼠的体重、改善了血脂水平，进一步说明运动可以改善肥胖大鼠的FGF21 抵抗现象，提高FGF21 的敏感性[6]。

骨骼肌是人体最大的组织，约占人体总质量的30%～40%。骨骼肌是一种高耗能器官，同时也是维持机体代谢稳态的重要组织。肌营养不良、肥胖等会导致骨骼肌正常功能出现变化，进而影响全身的新陈代谢水平[7]。骨骼肌调节机体新陈代谢的作用是通过其分泌的“肌细胞因子”实现的[8]。研究证实，FGF21也是肌肉细胞分泌的因子之一，它可以促进对葡萄糖的吸收利用并能提高胰岛素敏感性[9]。在健康状态下，骨骼肌中FGF21 的表达水平很低，循环中的FGF21 主要来自于肝脏。但在一些应激状态下，如饥饿、内质网应激、线粒体功能障碍等，肌源性FGF21的表达量就会显著上升[10，11]。近些年来的研究发现，在运动应激状态下，骨骼肌中FGF21 的表达水平也会受到影响。Tanimura等[12]在研究中发现，60 min的有氧运动提高了小鼠腓肠肌中FGF21 的基因和蛋白表达水平，这可能与运动激活了蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的活性有关。而Kartinah等[13]的研究发现，无论是正常大鼠还是肥胖大鼠，8周的高强度间歇运动比中等强度有氧运动更能显著提高腓肠肌中FGF21含量。

综上所述，目前有限的研究证据表明不同的运动方式或运动强度都会对骨骼肌FGF21的表达产生不同的影响，但运动诱导骨骼肌FGF21 表达的作用还未得到系统阐释。因此，本研究通过对肥胖大鼠进行有氧运动或抗阻运动干预，观察骨骼肌FGF21 表达水平的变化，并结合FGF21上游调控因子表达水平的改变，进一步探讨不同运动方式对骨骼肌FGF21表达的影响并对其调节机体代谢的潜在作用进行分析。

2 材料与方法

2.1 肥胖大鼠建模及实验分组

本研究以3 周龄雄性SD 大鼠为研究对象，大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠在SPF级动物房中进行饲养，动物房温度为22 ± 2℃，相对湿度为50% ± 5%，实验期间大鼠自由进食和饮水。

本研究首先构建高脂饮食诱导的单纯性肥胖大鼠模型。在适应性喂养1 周后，80 只大鼠利用高脂饲料（D12451，Research Diets，New Jersey，USA）继续饲养，20 只大鼠利用符合国家标准的啮齿类动物普通饲料进行饲养。建模期间，每日观察大鼠的生长和活动状态，每周定期测量大鼠的体重。饲养10 周后，称量所有大鼠的体重，按照“高脂饲料饲养的大鼠体重高于普通饲料饲养大鼠平均体重的20%即为单纯性肥胖大鼠”的标准[14]筛选出肥胖大鼠。将筛选出的肥胖大鼠随机分为安静对照组（OC组）、有氧运动组（OA组）、抗阻运动组（OR组），每组各10只。

2.2 运动干预方案

除OC组外，OA组和OR组大鼠分别进行8周的有氧运动和抗阻运动干预，大鼠在运动干预期间维持高脂饮食，自由进食和饮水。

2.2.1 有氧运动干预方案

OA组大鼠通过跑台运动进行有氧运动干预，每周训练5天，休息2天，每天训练时间为60 min。OA组大鼠首先完成了1 周的跑台适应性训练，然后利用动物气体代谢分析系统（Comprehensive Lab Animal Monitoring System， Columbus Instruments， Columbus，USA）测试大鼠的最大摄氧量（VO2max），测试方案如表1 所示，大鼠达到最大摄氧量的判断标准为：1）在电刺激的情况下大鼠仍无法坚持跑步，或2）出现摄氧量平台或摄氧量连续两次变化幅度不超过5%。

有氧运动训练的强度控制在60%～70% VO2max，根据大鼠的VO2max测算该强度对应的跑速，然后以此跑速进行4周的有氧运动训练。运动干预4周后，再次测定大鼠的VO2max 并重新测算跑速，该跑速用于后4周的有氧运动训练。根据测算，大鼠在1～4周的跑速为15 m/min，5～8周的跑速为20 m/min。

表1 大鼠最大摄氧量测试方案

2.2.2 抗阻运动干预方案

在参考文献研究的基础上，本实验室建立了“负重爬梯法”对大鼠进行抗阻运动训练[6]。爬梯长1.10 m，宽0.18 m，相临阶梯间隔0.02 m，训练时爬梯以80°角度倾斜放置在地面上。大鼠首先完成了1周的爬梯适应性训练，然后按照本实验室建立的实验方案[6]进行抗阻运动训练，每2 天训练一轮，每轮训练需完成8 次爬梯（由爬梯底部爬到顶部为1 次完整爬梯训练），次间休息2 min，必要时在尾部给予刺激。大鼠尾部设有负重装置，根据大鼠完成爬梯的情况逐级增加负荷。

2.3 大鼠取材及指标测试

2.3.1 取材

大鼠在完成最后一次训练24小时后禁食过夜，然后用10%水合氯醛溶液将大鼠麻醉处死并进行取材。通过大鼠腹主动脉取血5 mL，离心后取血清利用全自动生化分析仪检测血脂水平。剥离出腹股沟皮下白色脂肪、肾周脂肪、附睾脂肪及肩胛间棕色脂肪，用吸水纸吸干表面水分后称重。取大鼠腓肠肌，在预冷的生理盐水中漂洗后置于冰上剪碎，用锡铂纸包装后置于液氮中冷冻，然后转移至－80℃冰箱中保存，用于测试腓肠肌组织中FGF21、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、Akt的基因及蛋白表达水平，同时检测磷酸化Akt（p-Akt）的蛋白水平。

2.3.2 RT-PCR 检测腓肠肌组织中FGF21、PI3K、Akt的基因表达水平

将冻存的腓肠肌组织剪碎放入玻璃匀浆器中，加入TRIzol 试剂进行组织匀浆，按说明书步骤提取组织总RNA。以提取出的RNA为模板，配制20 μL的反转录反应体系合成cDNA。然后，再以cDNA 为模板，βactin 为内参，配制50 μL 的荧光定量PCR 反应体系进行基因扩增，扩增条件为：94℃4 分钟、94℃20 秒、60℃25 秒、72℃30 秒，共循环35 次。利用荧光定量PCR 仪（CFX 96 Conect，Bio-Rad，USA）进行荧光检测，再通过2-△△ct公式计算样本中FGF21、PI3K、Akt 的mRNA相对含量。实验中所需的引物均由上海生工生物技术有限公司按照GeneBank 数据库提供的基因序列（表2）合成。

表2 目的基因引物序列

2.3.3 Western Blot 检测腓肠肌组织中FGF21、PI3K、Akt、p-Akt的蛋白表达水平

将冻存的腓肠肌组织剪碎放入玻璃匀浆器中，加入RIPA 裂解液进行组织匀浆并提取组织样本中的总蛋白，将蛋白浓度统一调整至2 μg/μL。配置10%的SDS-PAGE 凝胶，按每孔20 μg 蛋白量进行上样，然后利用电泳分离蛋白，200 mA 恒流转膜1 h。然后用封闭液封闭1 h，加入稀释好的一抗（FGF21、PI3K、p-Akt稀释比为1∶1000，Akt 稀释比为1∶2000）4℃孵育过夜。取出膜后用TBST洗膜3次，每次5 min，然后加入HRP标记的二抗（稀释比1∶5000），室温摇床孵育1 h，然后用TBST 洗膜4 次，每次5 min。最后加入ECL 化学发光试剂反应3 min，曝光后显影，放入定影液中定影。用UVP凝胶图象处理系统Labworks 4.6软件分析目的条带的灰度值，通过比较目的条带和内参条带的灰度值，计算FGF21、PI3K、Akt、p-Akt的相对蛋白表达量。

2.4 统计学分析

实验所得数据利用SPSS 20.0 软件进行统计和分析，统计结果以平均值±标准差（±s）表示。三个组别间的数据通过单因素方差分析进行统计和比较，方差整齐的数据利用LSD 检验进行组间两两比较，方差不齐的数据利用Tamhane检验进行组间两两比较。以P＜0.05为具有显著的统计学差异。

3 结果

3.1 运动干预对肥胖大鼠形态学指标的影响

如表3 所示，各组大鼠在运动干预前的体重无显著差异。完成8 周运动干预后，OA 组和OR 组的大鼠体重显著低于OC 组（P＜0.01），并且OA 组大鼠体重显著低于OR 组（P＜0.01）。完成运动干预后，OA 组大鼠腹股沟皮下白色脂肪重量显著低于OC 组和OR 组（P＜0.05）；肩胛间棕色脂肪重量在三组间无显著差异；OA组大鼠肾周脂肪和附睾脂肪重量均显著低于OC组（P＜0.01），且OR 组的附睾脂肪重量显著低于OC 组（P＜0.05）。按照公式“脂体比=（肾周脂肪重量+附睾脂肪重量）/体重”计算各组大鼠的脂体比，结果显示，OA组大鼠的脂体比显著低于OC组（P＜0.05）。

表3 运动干预对肥胖大鼠形态学指标的影响

3.2 运动干预对肥胖大鼠血脂水平的影响

完成运动干预后大鼠血脂四项水平（图1）显示，OA 组和OR 组大鼠的总胆固醇（TC）水平分别为1.52± 0.26 mmol/L、1.36 ± 0.22 mmol/L，均显著低于OC组的1.95 ± 0.43 mmol/L（P＜0.01）；OA组和OR组的高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平分别为0.96 ± 0.23 mmol/L、0.83 ± 0.18 mmol/L，显著低于OC 组水平（1.26 ± 0.36 mmol/L）（P＜0.01;P＜0.05）；OA 组大鼠的甘油三酯（TG）水平（0.47 ± 0.11 mmol/L）显著低于OC组（0.77 ± 0.59 mmol/L）（P＜0.05）；OR 组大鼠的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平（0.21 ± 0.03 mmol/L）显著低于OC 组（0.29 ± 0.07 mmol/L）（P＜0.01）及OA组（0.27 ± 0.07 mmol/L）（P＜0.05）。

3.3 运动干预对肥胖大鼠腓肠肌FGF21、PI3K、Akt基因表达的影响

如图2 所示，8 周的有氧运动或抗阻运动干预后，OA 组和OR 组大鼠的FGF21 mRNA 相对表达量分别为17.58 ± 2.67、11.58 ± 1.99，均显著高于OC 组的1.01 ± 0.16（P＜0.01），并且OA 组也显著高于OR 组（P＜0.01）。PI3K mRNA 相对表达量在OR 组中为1.32 ± 0.24，显著高于OA 组的0.63 ± 0.08（P＜0.01），但与OC 组（1.03 ± 0.25）无显著差异；OA 组的PI3K mRNA 相对表达量显著低于OC 组（P＜0.01）。Akt 的mRNA相对表达量在OR组中为1.29 ± 0.15，显著高于OC 组（1.02 ± 0.18，P＜0.01）和OA 组（0.84 ± 0.12，P＜0.01），但OA组显著低于OC组（P＜0.05）。

3.4 运动干预对肥胖大鼠腓肠肌FGF21、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响

如图3 所示，8 周的有氧运动或抗阻运动干预后，OR组大鼠的FGF21蛋白相对表达量为1.36 ± 0.29，显著高于OC 组（P＜0.05），OA 组与OC 组无显著差异。PI3K和Akt的蛋白相对表达量在三组间均没有显著差异。Akt 在Thr308 和Ser473 两个位点发生磷酸化后才能被激活，经比较分析，Akt 在Thr308 位点的相对磷酸化水平在OR 组中为1.26 ± 0.13，显著高于OC 组（P＜0.05）和OA 组（0.90 ± 0.14，P＜0.01），OA 组与OC 组无显著差异；Akt 在Ser473 位点的相对磷酸化水平在OR 组中为1.28 ± 0.15，同样显著高于OC 组（P＜0.05）和OA组（0.82 ± 0.07，P＜0.01），而OA组显著低于OC组（P＜0.05）。

图1 运动干预对肥胖大鼠血脂水平的影响

图2 运动干预后肥胖大鼠腓肠肌FGF21、PI3K、Akt的基因表达水平变化

图3 运动干预后肥胖大鼠腓肠肌FGF21、PI3K、Akt、p-Akt的蛋白表达水平变化

4 讨论

在本研究中，肥胖大鼠经过8 周的有氧运动或抗阻运动干预后，体重明显降低，并且有氧运动的减重效果更加显著。相对于持续性的有氧运动，抗阻运动存在一系列的间歇休息期，通常情况下，抗阻运动过程中的能量需求，特别是脂肪供能比例相对偏低，这可能是有氧运动在减脂控体重方面的效果优于抗阻运动的原因之一。此外，本研究发现有氧运动或抗阻运动干预均在一定程度上改善了肥胖大鼠的血脂水平；相比于抗阻运动，有氧运动能更加有效地减少肥胖大鼠的内脏脂肪（肾周脂肪和附睾脂肪）堆积。杨星雅等[15]在研究中发现，8周有氧运动干预显著降低了大鼠的附睾脂肪重量，而抗阻运动在减少脂肪堆积方面的效果并不显著。以上研究结果说明，规律的体育锻炼，尤其是中等强度有氧运动，是减脂控体重的有效手段。

在哺乳动物体内存在两种主要的脂肪组织，即白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪的主要功能是将多余的能量以甘油三酯的形式储存起来，这是导致体重增加的关键因素；棕色脂肪的主要功能是通过线粒体内膜上的解耦联蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）将脂肪酸氧化和ATP 产生解耦联，以非颤栗性产热的形式使能量以热量的形式散失[16]。白色脂肪在一些激活剂的刺激下可被诱导产生具有棕色脂肪样的脂肪细胞，它与经典的棕色脂肪有相似的生物学特性和产热功能，这个过程被称为“白色脂肪棕色化”。通过诱导白色脂肪棕色化可在一定程度上提高机体的能量代谢率，达到消耗脂肪、减轻体重的目的。研究发现，有氧运动训练能够促进白色脂肪棕色化的发生，进而提高机体的能量代谢水平[17]，尤其对皮下白色脂肪的诱导作用更加显著[15]。在本研究中也发现，与安静对照组相比，有氧运动训练显著降低了肥胖大鼠腹股沟皮下白色脂肪的重量，可能通过诱导白色脂肪中UCP1、PRDM16等因子的表达进而促进了白色脂肪棕色化的发生，增加了机体的能量消耗并减轻了体重[18]。相对而言，抗阻运动训练并没有显著降低大鼠白色脂肪的重量，棕色脂肪重量也未见明显增加，显示出其在促进白色脂肪棕色化方面的作用弱于有氧运动[15]。

作为一种“运动因子”，FGF21在调节糖、脂代谢方面的作用已在诸多研究中得到证实[3，19]。FGF21 主要在肝脏中合成并分泌，研究发现骨骼肌也可表达FGF21 并发挥生理调节作用[20]。有研究指出，60 min的中等强度有氧运动可显著提高小鼠腓肠肌中FGF21基因和蛋白表达水平[12]。相比于中等强度有氧运动，高强度间歇运动在长期（8 周）运动干预过程中能更加显著地提高肥胖大鼠腓肠肌中FGF21 含量，有助于促进对葡萄糖和脂肪酸的利用，缓解肥胖导致的FGF21抵抗现象[13]。在本研究中，8周的有氧运动干预提高了肥胖大鼠腓肠肌FGF21 基因表达水平，但并没有提高其蛋白表达水平。有氧运动显著降低了肥胖大鼠体重及体脂水平，推测在有氧运动干预过程中FGF21 敏感性提高，使得肥胖大鼠糖、脂代谢形成了新的稳态，可能通过负反馈调节作用抑制了FGF21蛋白的合成。此外，本研究还发现8 周的抗阻运动干预不仅提高了肥胖大鼠腓肠肌FGF21 基因表达水平，也促进了其蛋白表达水平的提升。而在Kim 等[21]的研究中，通过对Zucker 糖尿病肥胖大鼠进行12 周的抗阻运动干预，发现大鼠比目鱼肌中FGF21 含量有了显著提升，而在腓肠肌中并未观察到这种现象。在对实验方案进行比较分析后发现，实验动物模型（本研究所用动物模型为饮食诱导的肥胖大鼠）、抗阻运动干预时间及运动强度的差异均可能是导致研究结果不一致的原因；此外，Kim等的研究中检测的是骨骼肌中FGF21 含量，而非基因或蛋白表达水平。目前有限的研究证据表明，抗阻运动训练对于骨骼肌中FGF21的表达水平有一定的上调作用。

在肝脏中，FGF21的表达主要受PPARα的调控；而在骨骼肌中，研究发现PI3K/Akt 是调控FGF21 表达的主要信号通路[22]。Tanimura等[12]的研究指出，一次性急性有氧运动可通过激活Akt 的活性进而上调骨骼肌FGF21 基因和蛋白表达水平。本研究发现，抗阻运动干预提高了肥胖大鼠腓肠肌PI3K、Akt 的基因表达水平，但并未显著上调其蛋白表达水平。更为关键的是，抗阻运动干预显著增强了Akt在Thr308和Ser473位点的磷酸化，说明抗阻运动干预有效激活了Akt 的活性，这可能是引起腓肠肌FGF21表达水平上调的重要原因之一。相对于抗阻运动，有氧运动在激活PI3K/Akt 信号通路中作用并不显著。相比较而言，抗阻运动训练主要通过增粗肌纤维使肌肉肥大，进而提高基础代谢率并促进机体的能量消耗，而有氧运动则是通过增加脂肪供能比例促进能量消耗[9]。因此，抗阻运动对肌肉的有效刺激更为显著，这可能是抗阻运动引起Akt磷酸化水平提高的原因之一。

随着研究的深入，肌源性FGF21在调节机体糖、脂代谢及能量代谢方面的作用逐渐被研究者所认识，但肌源性FGF21 对骨骼肌的直接作用尚不完全清楚。Kim等[23]在研究中发现，骨骼肌中自噬功能缺陷及其导致的线粒体功能障碍会引起FGF21 表达上升，这有助于减轻高脂饮食导致的肥胖及胰岛素抵抗。另有研究指出，运动可改善高脂饮食小鼠的葡萄糖耐受不良状况，这与FGF21 有效激活骨骼肌中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）密切相关[24]。目前研究通常认为，骨骼肌中表达的FGF21一方面通过激活AMPK提高线粒体的生物学活性，进而促进脂肪酸的β氧化并调节机体的能量代谢[24，25]；另一方面，骨骼肌中表达的FGF21会随血流循环被输送到脂肪组织，提高白色脂肪中FGF21含量，进一步诱导沉默信息调节因子2 相关酶1（SIRT1）、过氧化物酶体增殖激活受体辅激活因子1α（PGC-1α）、UCP1等因子的表达，促进白色脂肪棕色化的发生并增加能量消耗[13，26]。目前有关运动与肌源性FGF21调控作用关系的研究还处于起步阶段，本研究也存在一定的局限性，未能准确确定和检测骨骼肌中FGF21 下游信号因子的表达情况，后续应通过更加系统的实验研究分析FGF21在骨骼肌中的生理作用途径和机制。此外，当前研究结果提示，运动与FGF21水平之间可能存在“量-效”反应关系，适宜的运动类型、运动强度和运动持续时间能够有效促进FGF21 生理作用的发挥，这也是需要在后续研究中深入探讨的重要内容。