獭兔 MITF不同可变剪接体对黑色素沉积的影响

卢婷婷，王曼曼，陈 实，申金钰，周 彤，鲍国连，陈 阳,3，吴信生,3

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏扬州 225009;2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州 310021；3.农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏扬州 225009)

毛色是皮毛动物的重要经济性状之一，也是一种可利用的遗传标记，在人以及小鼠上已有研究[1-2]。獭兔，学名力克斯兔，因毛色众多而著名，国内引进的主要有白色、青紫蓝色、花色和海狸色等14种色型，深受消费者喜爱。已知哺乳动物的毛色主要决定于黑色素细胞产生的真黑素和褐色素之间的转换,而黑色素的形成是多种不同的基因以及环境因素共同决定的[3-4]。

小眼畸形相关转录因子(microphthalmia associated transcription factor, MITF)在哺乳动物皮毛的黑色素形成中发挥重要作用，其起源于一种放射性诱导的突变小鼠，后代小鼠表现为小眼畸形，早发性耳聋，皮毛和虹膜色素减退。根据有关小鼠等的文献报道，编码不同蛋白异构体的MITF基因都由9个外显子组成，2～9号外显子序列是一致的，1号外显子是不相同的[5]。MITF基因在黑色素细胞特异性表达中发挥了重要作用，并且参与多种细胞发育、分化和功能调节[6-7]。但在兔上，MITF不同可变剪接体对黑色素沉积的影响如何？目前尚未见相关报道。此外，有研究表明MITF可直接调控毛色相关基因的转录，包括TYR、TYRP-1和TYRP-2(DCT)等酪氨酸家族[8]。MITF可调控与黑素小体成熟及运输密切相关的基因表达，包括GPNMB、PMEL-17等[9-10]。其中，GPNMB作为细胞粘附分子、黑素体蛋白、细胞表面受体和可溶性配体发挥重要作用[11]。PMEL-17基因的正常表达是淀粉样纤维形成的关键，其表达受MITF基因的调控[12-13]。因此，本研究选取TYR、GPNMB、PMEL-17基因，来分析MITF不同可变剪接体的下游信号 通路。

不同的剪接位点产生不同的可变剪接体，可能具有不同的基因功能和蛋白质多样性，基于此，本研究克隆MITF6种不同可变剪接体，通过检测下游基因mRNA表达量和黑色素细胞中黑色素的沉积量来验证不同可变剪切体对黑色素沉积的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验样品 试验选用购于江苏扬州施桥兔场的2月龄獭兔，采集皮肤和脾脏组织于 -70 ℃保存。试验细胞选择扬州大学动物遗传资源评价实验室构建的兔黑色素细胞系[14]。

1.1.2 试验试剂 总RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。DNA Ligation Kit Ver.2.1、E.coliDH5α感受态细胞、pMD-18T vector、限制性内切酶HindⅢ、NheⅠ和SacⅡ购自TaKaRa公司。FastQuant RT Kit、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQTMSYBR qPCR Mster Mix和Exfect 2000转染试剂盒购自诺唯赞生物科技(南京)有限公司。Melanin购自Sigma公司。Phosphate Buffered Saline购自HyClone公司。胎牛血清、DMEM和M254培养基购自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1MITF不同可变剪接体CDS区扩增 从家兔皮肤、脾脏和黑色素细胞中提取总RNA，以混合样为模板反转录合成cDNA第1链。根据NCBI上预测的兔MITF基因可变剪接体mRNA序列，使用primer 5.0软件进行引物设计，引物序列见表1。50 μL的反应体系为10 μL Buffer、18 μL灭菌水、1 μL cDNA、上游和下游引物各 2 μL、1 μL DNA 聚合酶，完全混匀后按照程序进行PCR扩增。回收PCR产物，连接到pMD18-T载体上构建重组质粒，双酶切鉴定后，选取阳性质粒送擎科生物技术(南京)有限公司测序。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.2 生物信息学分析 运用MEGA 6.0进行系统进化树的构建，Bootstrap分析重复数为 1 000。通过PSORT Ⅱ Prediction软件( https://psort.hgc.jp/form2.html) 进行亚细胞定位预测分析。

1.2.3 pEGFP-N1-MITF 质粒构建和细胞转染 将pEGFP-N1质粒与构建好的pMD19-T- MITF X1、X2、X5和X6质粒同时进行Hind Ⅲ和SacⅡ双酶切；pEGFP-N1质粒与pMD19-T-MITF X3、X4质粒同时进行Nhe1和SacⅡ双酶切。酶切体系：限制性内切酶各1 μL，10×Quick Cut Buffer 5 μL，DNA 12 μL，灭菌水31 μL。酶切程序为37 ℃、15 min。通过电泳鉴定成功后，纯化回收酶切后的目的条带。将pEGFP-N1和MITFCDS双酶切后的产物进行连接。反应体系：MITFCDS产物加入4 μL，pEGFP-N1产物加入1 μL，SolutionⅠ加入5 μL。置于200 μL PCR管中混合均匀。反应程序：16 ℃、30 min。制备pEGFP-MITF无内毒素质粒DNA并进行纯化。将MITF不同可变剪接体重组质粒通过Exfect转染试剂转入黑色素细胞中，置于37 ℃和5% CO2培养箱中孵育24 h后收取细胞。

表2 荧光定量引物Table 2 List of primer used in qRT-PCR

1.2.5 黑色素细胞含量测定 收集转染24 h后的永生化黑色素细胞，加入1 mL 1 mol/L的NaOH溶解细胞，将全部溶液移入无菌的1.5 mL 离心管中，置于金属浴中，80 ℃、1 h。使用酶标仪在500 nm和650 nm波长处进行吸光值测定。波长在500 nm处测得黑色素细胞中的总黑色素含量，在650 nm波长处测得黑色素细胞中的真黑色素的含量。使用黑色素标准品进行标准曲线的制作。每组样品重复3次，根据测定的标准曲线最终算出细胞中的黑色素含量。

1.2.6 数据分析 采用2-△△Ct法对数据进行定量分析，并以“平均数±标准差”表示，采用SPSS 22统计软件进行差异显著性分析。试验组和对照组两组数据之间进行成对二样本t检验分析，P< 0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 MITF不同可变剪接体基因结构比较分析

根据NCBI预测的MITF可变剪接体序列设计引物，经扩增共发现MITF基因的6种可变剪接体，分别命名为MITF X1、MITF X2、MITF X3、MITF X4、MITF X5和MITF X6。由图1可以看出，6种MITF剪接体主要存在4个可变剪接位点，分别在第1外显子(1～40 bp)处、第2外显子(56 bp)处、第2外显子(221 bp)和第7外显子(882～899 bp)处。MITFmRNA前体在开始形成mRNA成熟体的过程中，第1～10外显子正常剪接，形成MITF X1。MITF X2在第7外显子处，缺失18 bp，发生外显子遗漏；MITF X3与MITF X1相比，在第1外显子5′端处(40 bp)存在1个65 bp高变区，发生可变5′端剪接；MITF X4与MITF X1相比，在第1外显子5′端处(40 bp)存在1个65 bp高变区，发生可变5′端剪接，在第7外显子(882～899 bp)处存在18 bp的缺失区，发生外显子遗漏；MITF X5与MITF X1相比，缺失第1外显子，第2外显子5′端处缺失56 bp，发生外显子遗漏；MITF X6与MITF X1相比，缺第1外显子，第2外显子5′端处(221bp)存在1个29 bp高变区。

白色框表示缺失碱基，灰色框代表不同碱基，黑色框表示相同碱基

2.2 MITF系统进化树分析

将兔MITF基因与人、猪、羊、猩猩、羊驼、马、犬、猫和鸡的MITF基因序列输入到MEGA 6.0软件中，进行系统进化树分析。由图2可知，构建的进化树大体分成两支，家禽鸡作为独立一支，剩余的10个物种构成另一个独立分支，家兔MITFX1～X6剪接体在其中的一个分支上，与人和猩猩的分子进化距离最近，表明亲缘关系最 接近。

图2 不同物种 MITF基因序列系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree constructed for MITF genes of different species

2.3 MITF不同可变剪接体的亚细胞定位预测与验证

利用PSORT Ⅱ在线软件对MITF蛋白进行亚细胞定位的预测，结果显示， MITF X1和MITF X2蛋白69.6%位于细胞核，13.0%位于细胞质，8.7%位于线粒体； MITF X3和MITF X4蛋白69.6%位于细胞核，13.0%位于线粒体，8.7%位于细胞质；MITF X5蛋白56.5%位于细胞核，21.7%位于细胞质，17.4%位于线粒体； MITF X6蛋白65.2%位于细胞核，17.4%位于细胞质，8.7%位于线粒体。MITF X1和 MITF X2蛋白亚细胞定位一致，主要定位在细胞核和细胞质，MITF X3和MITF X4蛋白亚细胞定位一致，主要定位在细胞核和线粒体， MITF X5和MITF X6蛋白主要定位在细胞核和细胞质。

将构建的MITFX1～X6的真核表达载体转染永生化黑色素细胞，利用荧光显微镜观察 (图3)，显示基本与预测结果相一致，主要表达在细胞核。

2.4 pEGFP-N1-MITF各可变剪接体真核表达载体构建

将扩增的MITF基因PCR产物进行切胶回收，并连接到pEGFP-N1表达载体，重组质粒经转化，X1、X2、X5、X6提取后经HindⅢ和SacⅡ双酶切，X3、X4提取后经NheⅠ和SacⅡ双酶切，根据电泳鉴定得到pEGFP-N1载体片段和MITFCDS目的片段，片段大小一致，表明质粒构建正确(图4)。

2.5 RT-qPCR检测下游基因mRNA表达量

利用荧光定量PCR检测MITF不同可变剪接体对TYR、GPNMB、PMEL-17表达量的影响。结果显示MITF X1～X3对TYR、GPNMB均有显著增加(P<0.05)，MITF X4显著增加GPNMB表达量(P<0.05)，MITF X2显著增加PMEL-17表达量(P<0.05)，其他MITF剪接体形式的过表达对下游基因影响不显著(P>0.05)(图5)。说明MITF不同剪接体形式对黑色素沉积信号通路下游基因的作用不同。

2.6 酶标仪检测黑色素含量变化

收集转染后的黑色素细胞，碱裂解处理细胞，使用酶标仪测定黑色素细胞中总黑色素、真黑色素和褐黑色素的含量。黑色素含量测定发现，MITF X1～X6剪接体显著增加黑色素细胞中总黑色素和真黑色素含量(P<0.05)，均可影响黑色素细胞黑色素沉积(图6)。

A.pEGFP-N1- MITF X1;B.pEGFP-N1- MITF X2;C.pEGFP-N1- MITF X3;D.pEGFP-N1- MITF X4; E.pEGFP-N1- MITF X5; F.pEGFP-N1- MITF X6;G.pEGFP-N1;1.荧光；2.明场

图4 pEGFP-N1-MITF各剪接体双酶切鉴定结果Fig.4 Double restriction enzyme digestion of products of plasmids of different pEGFP-N1-MITF splicing

3 讨论与结论

哺乳动物毛色与黑色素密切相关，黑色素的产生和成熟是一个复杂的调控过程，受许多基因的影响，其中MITF基因对黑素细胞作用和黑素合成具有重要调控作用[15-16]。目前，在人、小鼠、绵羊、羊驼、大鼠、仓鼠、鸡、鹌鹑和斑马鱼等动物已成功克隆出MITF基因，这些序列同源性较高，特别是MITF的bHLHZip结构区、2个活化区和MAPK靶序列(MITF的作用位点)[17]。在本研究中，成功克隆兔MITF基因的6个可变剪接体，通过系统进化分析发现，兔MITF基因与马、绵羊和犬等哺乳动物的进化距离较近，其次与人、猩猩相近，与非哺乳动物鸡的进化距离较远。说明MITF基因在生物进化上具有保守性，同时也体现MITF基因在生物体上具有的重要的功能性和在不同物种的结构稳定性。目前关于家兔MITF基因不同可变剪接体的研究较少，调控黑色素细胞以及黑色素的合成是何种可变剪接体在发挥作用仍不清楚。

A.TYR基因；B.GPNMB基因；C. PMEL-17基因；**表示P<0.01，差异极显著；*表示P<0.05，差异显著

**表示P<0.01，差异极显著；*表示P<0.05，差异显著

基于此，本试验根据NCBI预测数据与已有文献报道，设计MITF编码区特异性引物，采用RT-PCR结合TA克隆测序的方法，鉴定兔MITF基因的6种可变剪接体，分别命名为MITF X1、MITF X2、MITF X3、MITF X4、MITF X5和MITF X6(GenBank登录号：MK801776、MK825547、MK85548、MK825549、MK825550 和MK825551)。利用软件对MITF不同可变剪接体翻译的蛋白进行亚细胞定位，发现不同可变剪接体的蛋白都主要位于细胞核，少量位于细胞质和线粒体，其中MITF X5蛋白位于细胞核的比例最小。通过构建过表达载体转染到黑色素细胞中，发现MITF主要在细胞核中表达，与预测结果相一致，这也与MITF转录因子的特性相符，主要在细胞核中发挥作用。

为了进一步探究不同可变剪接体对黑色素沉积的作用，构建不同可变剪接体的过表达载体。已知MITF参与色素沉着过程是直接作用于基因的转录调节，如MITF基因可激活酪氨酸酶基因家族(TYR、TYRP1和TYRP2)，通过与它们的启动子相结合来调控它们在黑色素细胞中特异性表达，同时能参与外界刺激对黑色素细胞中黑素生成的调控，进而来参与黑色素生成的调控[18-19]。因此，本研究利用荧光定量PCR检测，发现MITF X1～X3过表达显著增加TYR、GPNMB的mRNA表达量，其他MITF剪接体的过表达对下游基因影响不显著，提示不同剪接形式对黑色素沉积信号通路下路基因的作用并不相同；同时黑色素含量测定发现，MITF X1～X6剪接体显著增加了黑色素细胞中总黑色素和真黑色素含量，表明MITFN端的剪接变化并不影响黑色素沉积功能。

综合而言，MITFN端的剪接变化并不影响黑色素沉积功能，但不同剪接体的下游信号通路存在差异。该结果有助于清晰兔MITF不同可变剪切体对黑色素沉积的影响，为我们更科学、更精准地进行獭兔的毛色选育提供了理论依据。