水溶性酞菁锌纳米粒的合成及光动力活性研究

李林森，徐晖，刘瑞明，汪亚伦∗

（1.沈阳医学院基础医学院生物化学教研室，辽宁沈阳 110034；2.沈阳药科大学药学院药剂教研室；3.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2016 级）

光动力学疗法（photodynamic therapy，PDT）作为一种治疗肿瘤的新方法，越来越受到医疗工作者和学者们的关注［1－2］。PDT 的基本原理是在肿瘤病变组织摄取一定量光敏剂后，利用特定波长的光照射肿瘤部位，光敏剂会将肿瘤组织的分子氧（O2） 转化为具有细胞毒性的单线态氧（O1）或自由基，进而破坏肿瘤细胞来达到治疗肿瘤的目的［3］。光敏剂作为氧分子形态转换的关键因子，一直是PDT 研究的重点，而酞菁作为第二代光敏剂，具有稳定的化学性质、适宜的治疗波长（650～700 nm） 以及体内滞留时间短等优点［4－5］。但是酞菁分子疏水性强的特点，也限制了其在临床的进一步应用［6］。因此，本研究利用自组装纳米载药系统提高酞菁锌（ZnPc） 光敏剂的水溶性，通过四甲基偶氮唑蓝（MTT） 法考察其对肝癌细胞HepG2 的光动力学作用，为PDT 抗肿瘤的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器 Synergy 4TM混合式多功能读板机（美国BioTek 公司），激光粒度测定仪（英国Malvern Panalytical 公司），LED 光能祛痘灯（青岛阳光动力生物医药技术有限公司），BSA124S 电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 材料 酞菁锌（ZnPc） （中国药品生物制品检验所，CAS：14320－04－8），聚乳酸－聚羟基乙酸（poly （lactic－co－glycolic acid，PLGA，Mw：7 000－17 000）、聚乙二醇 （polyethylene glycol，PEG，Mw：2 000）、透析袋MD25 （8 000－14 000 D）、脱氧胆酸钠（SDC，Mw：414.56） （北京索莱宝科技有限公司），N－甲基吡咯烷酮（NMP）、1－ （3－二甲氨基丙基）－ 3－ 乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N－羟基琥珀酰亚胺（NHS） （美国Amresco 公司），MTT 细胞增殖与毒性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），细胞培养瓶、96 孔板（美国Corning 公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），RPMI－1640 培养基（美国Gibco BRL 公司），胰蛋白酶（美国Invitrogen 公司），人肝癌细胞HepG2 细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞库）。

1.3 方法

1.3.1 溶剂扩散法制备ZnPc－PLGA－PEG （zinc phthalocyanine－poly （lactic－co－glycolic acid）－polyethylene glycol） 纳米粒和PLGA－ PEG （poly（lactic－co－glycolic acid）－polyethylene glycol） 空白纳米粒并行粒径测量 称取100 mg PLGA、0.96 mg NHS、1.59 mg EDC 溶于2 ml NMP 中，冰水浴搅拌2 h；再称取16.67 mg PEG 溶解于1 ml NMP中，完全溶解后，缓慢加入到上述PLGA 溶液中反应24 h，透析后离心浓缩至3 ml。

将上述反应液平均分成2 份，取一份缓慢滴加到纯化水中至15 ml，得到PLGA－PEG 空白纳米粒；精确称量10.0 mg ZnPc 溶解于含有45 mg SDC 的1.5 ml NMP 中，与PLGA－PEG 溶液混合后，缓慢滴加到纯化水中至30 ml，得到ZnPc－PLGA－PEG纳米粒。标准曲线法测定ZnPc 药物浓度。

ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒和PLGA－PEG 空白纳米粒在室温下静置15 min 后，使用激光粒度仪的Malvern 系统 （Malvern ZEN，英国 Malvern Panalytical公司） 通过动态光散射测定两者平均粒径，测量多分散指数（PDI） 以评估ZnPc－PLGAPEG 纳米粒粒度分布，结果取3 次测量值的平均值。

1.3.2 细胞培养 在含有100 单位／ml 的双抗（青霉素与链霉素） 和体积分数10%的胎牛血清的RPMI－1640 培养基中进行HepG2 细胞培养，当细胞长满培养瓶底部80%～90%时，用质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化并传代培养。当细胞生长到对数生长期时进行细胞毒性PDT 检测实验。

1.3.3 MTT 法测定ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒和PLGA－PEG 空白纳米粒对HepG2 细胞的活力作用将处于对数生长期的HepG2 细胞用0.25%胰蛋白酶（含有EDTA） 消化，培养基终止消化后离心收集细胞，用含有10%胎牛血清的RPMI－1640 培养基重新悬浮细胞至密度为1.5×105个／ml 后，以每孔100 μl 细胞液迅速接种在96 孔培养板中，置于37 ℃培养箱中孵育16 h。更换新鲜培养基后加药。设1 个对照组（只加培养液）、5 个实验组（ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒终浓度分别为0.01、0.1、1、10 和100 μmol／L） 及等比例稀释的5 个PLGA－PEG 空白纳米粒组，每组为4 个复孔，置于37 ℃培养箱中孵育2 h；待细胞达到对数生长期后，更换培养基，用波长670 nm 的LED 灯光照5 min （光剂量约7.5 J／cm2） 后避光置于培养箱中；暗毒性实验除未光照外，其他处理方式相同。16 h 后，利用MTT 法检测细胞存活率并绘图。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 5 软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒和PLGA－PEG 空白纳米粒的制备及粒径考察 通过溶剂扩散法制备的PLGA－PEG 空白纳米粒和ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒均以单体形式存在，稳定且不易聚集。PLGA－PEG 空白纳米粒呈乳白色，并带有浅蓝色乳光，ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒呈深蓝色。经检测，PLGA－PEG 空白纳米粒和ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒的粒径分别为 （99.0 ± 50.3） nm 和 （101.0 ±47.1） nm，见图1，PDI 分别为0.258 和0.217。ZnPc 的装载增加了ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒的粒径。

2.2 ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒和PLGA－PEG 空白纳米粒的光毒性及暗毒性实验 随着ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒浓度的增加，在光照条件下，肿瘤细胞的存活率不断下降，在10 μmol／L 的浓度下，肿瘤细胞的存活率只有4.6%，见图2A；而同样条件下的非光照组，肿瘤细胞的存活率一直保持在95%以上，见图2B。在对未装载ZnPc 的PLGAPEG 空白纳米粒进行光毒性和暗毒性的实验中发现，肿瘤细胞的存活率未发生明显变化，这与ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒的暗毒性结果相近，均不影响细胞的正常生长。见图3。

图2 ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒的光毒性（A） 及暗毒性（B）

图3 PLGA－PEG 空白纳米粒的光毒性（A） 及暗毒性（B）

3 讨论

在PDT 研究中，阻碍酞菁类光敏剂临床应用最主要的因素即为其水溶性较差。一些研究中利用表面活性剂，如蓖麻油、吐温等的加入，可以提高酞菁光敏剂的溶解性，但是也会带来副作用［7］。因此，本实验通过纳米载药系统改善酞菁锌（ZnPc） 的水溶性及稳定性，取得了很好的效果。得到的ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒在水溶液中能够长时间均匀存在，不易聚集，可以作为一种新型光敏剂开展进一步体内PDT 研究。

在PDT 研究中，光敏剂在光照（光毒性） 和非光照（暗毒性） 条件下对细胞的杀伤作用是考察其性质的重要指标之一，也是其临床进一步应用可能性的重要参考。利用MTT 检测方法证明，在光照条件下，ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒对HepG2细胞具有明显的杀伤和抑制作用，在浓度10 μmol／L 的ZnPc 纳米粒PDT 作用下，肿瘤细胞存活率小于5%；而非光照条件下，在各个浓度下，肿瘤细胞的存活率均大于95%，说明对肿瘤细胞产生的杀伤不是光敏剂的直接作用，而是光敏剂、光和氧气等诸多因素共同作用的结果。在非光照条件下，光敏剂对细胞不会产生毒性作用，这在临床应用中具有很大的益处，我们可以利用光源照射部位的选择，提高PDT 治疗的靶向性。

通过纳米粒子装载ZnPc 的方式可以提高光敏剂的光动力活性，但是纳米粒子组成材料自身对细胞存活率的影响也需要进一步考察。高分子材料的选择对于纳米粒子的组装起着至关重要的作用，其中材料的安全性是重中之重。在本实验中以PLGA－PEG 空白纳米粒作为对照，同样进行了肿瘤细胞光毒性和暗毒性的考察。结果显示，在光照和非光照条件下，PLGA－PEG 空白纳米粒对肿瘤细胞的生长均无影响，说明ZnPc－PLGA－PEG纳米粒对肿瘤细胞的杀伤作用全部来自于ZnPc 的PDT 作用，PLGA－PEG 空白纳米粒的组装材料是安全的。

综上所述，ZnPc－PLGA－PEG 纳米粒是一种安全、可靠的新型光敏剂，具有水溶性好、性质稳定等特点，对于人肝癌细胞HepG2 具有很好的杀伤和抑制作用，具有良好的临床应用价值。