南瓜含糖量相关QTL的标记加密及候选基因预测

王曼曼 屈淑平 黄河勋 薛舒丹 吴廷全 李俊星 戴祖云 钟玉娟,*

(1 广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州 510640； 2 东北农业大学园艺园林学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3 江苏沿江地区农业科学研究所， 江苏 南通 226541；4 安徽江淮园艺种业股份有限公司，安徽 合肥 230000)

中国南瓜(Cucurbitamoschata)是葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbita)主要栽培种之一[1]，在全世界范围内广泛栽培，具有重要的经济价值[2-3]。果实品质是南瓜分子育种研究关注的重点，其中糖分作为南瓜果实甜味口感的来源，其组分和含量是衡量果实品质的一项重要指标[4]。近年来，DNA分子标记技术不断发展，其多态性高、遗传稳定、开发成本低等优势也日益突显，分子标记技术在南瓜等葫芦科作物分子育种过程中的应用也越来越广泛[5-6]。Harel-Beja等[7]以甜瓜品种PI 414723和Dulce为亲本构建重组自交系，开发了600对分子标记用于遗传图谱的构建和甜瓜果实性状的数量性状基因座(quantitative trait locus, QTL)定位，得到3个与果实可溶性固形物含量相关的QTL位点，分别命名为tss2.1、tss2.2和tss5.1。Hashizume 等[8]以西瓜自交系(H-7)为材料构建了 F2和 BC1群体，并开发了477个随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)标记、53个限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)标记、23个简单重复序列(inter-simple sequence repeat, ISSR)标记和1个同工酶标记，构建了一份高密度的西瓜连锁图谱，经过遗传连锁分析将西瓜糖含量相关QTL位点定位在8号连锁群上。Ren等[9]以果实甜度差异显著的西瓜材料为亲本构建了重组自交系(recombinant inbred line，RIL)群体，发现液泡膜转运蛋白基因ClTST2和细胞质膜转运蛋白基因ClSWT是西瓜果实中转运葡萄糖、果糖和蔗糖的关键基因，且这2个基因的表达量均与西瓜果实含糖量呈正相关。

含糖量作为南瓜[10-12]、甜瓜[13]等葫芦科作物重要的品质性状，其相关研究还很少，且多集中于分析其代谢途径，Wyatt等[11, 14]以高糖含量(Sweet REBA)和低糖含量(Lady Godiva)的美洲南瓜为材料进行转录组测序，发现了18个与蔗糖代谢有关的基因，其中蔗糖磷酸合成酶在蔗糖合成过程中具有较高的酶活性，推测其可能对果实中蔗糖的合成起调控作用。本研究前期运用高通量测序技术获得了一份中国南瓜的高密度遗传图谱, 对中国南瓜的含糖量相关性状进行了初定位，得到了3个与中国南瓜葡萄糖含量、蔗糖含量、蔗糖/葡萄糖含量相关的QTL位点[15]，但是目前还未找到控制南瓜果实含糖量的关键基因。

我国是南瓜消费大国。南瓜产业在我国农业种植业结构调整、现代都市农业以及提高人民生活水平等方面发挥着重要作用。对南瓜果实而言，其糖组分及含量是果实甜度的主要影响因素，南瓜的糖分转化模式与其他作物不同，且南瓜含糖量性状是复杂的数量性状，遗传主效应与环境存在明显的互作效应，传统的生理与遗传学研究方法很难实现其遗传本质的深层次分析，主要表现为无法明确在复杂的糖代谢和糖转运基因网络中影响和决定南瓜果实糖积累的关键基因节点，更无法针对关键基因开发标记并用于分子标记辅助育种，进而导致对南瓜含糖量这一核心目标性状的决定机制认识落后、选择效率低，阻碍了南瓜品质改良工作的深入开展。因此，面对日益提高的消费需求，通过对南瓜糖分积累分子机制的研究，结合高通量筛查技术，寻找控制南瓜糖含量关键基因，明确南瓜糖的合成调控作用机制，对建立高效南瓜品质育种分子体系和提高南瓜育种水平具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料中国南瓜CMO-E(P1)和CMO-97(P2)，均由广东省农业科学院蔬菜研究所黄河勋研究员提供。其中CMO-E是由泰国引进在广东多代自交纯化的高代自交系，其蔗糖/葡萄糖在0.15～0.28之间，CMO-97是广东本地的高代自交系，其蔗糖/葡萄糖在7.26～7.66之间。以蔗糖/葡萄糖低的CMO-E作为母本，蔗糖/葡萄糖高的CMO-97作为父本，杂交获得F1，F1自交获得200株F2分离群体。所有材料均种植于广东省农业科学院白云基地，常规方法管理，人工杂交授粉。为保证果实的质量，每个单株只保留一个瓜，在果实达到商品成熟期时进行采摘，用于糖含量的检测。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 使用CTAB法提取南瓜亲本及200株F2群体的基因组DNA，用ND-2000C超微量分光光度计(Thermo，美国)检测DNA的浓度和纯度， OD260/OD280≥1.8时，稀释至100 ng·μL-1，于-20℃条件下保存备用。

1.2.2 果实糖含量的测定及相关性状的遗传分析 待果实进入成熟期后进行取样，将所取新鲜南瓜果肉于-80℃冰箱保存备用，随后分批对所取样品进行冷冻干燥处理，将冷冻干燥后的果肉研磨成粉状，采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)技术测定果实中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量(每个样品设3次生物学重复和3次技术重复)。统计糖含量的数据，并对其进行遗传分析。

1.2.3 蔗糖/葡萄糖初定位区间(qs/g19-a)分子标记开发及筛选 前期定位结果显示蔗糖/葡萄糖QTL初定位区间(qs/g19-a)位于19号连锁群107.67～120.30 cM，位于南瓜参考基因组[16]的7号染色体上。结合参考基因组信息和亲本重测序数据，使用Primer 5.0软件在蔗糖/葡萄糖QTL候选区间内均匀设计并合成50对InDel引物，利用亲本和F1单株进行引物筛选，将PCR产物在8%非变性聚丙烯凝胶上进行电泳检测，将扩增条带清晰且在亲本间存在显著差异的多态性引物用于F2群体的扩增。根据广东省蔬菜新技术研究重点实验室前期的高通量测序结果[15]，找到蔗糖/葡萄糖QTL候选区间内所有单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点及其侧翼序列，用于竞争性等位基因特异性扩增(kompetitive allele specific PCR, KASP)标记的开发。利用PARMS SNP在线引物设计软件设计KASP引物。每个标记包含5条引物，其中2条荧光通用引物包含在PARMS 2X Master Mix中，其余3条为标记特异引物；特异引物中，1条为标记位点的特异引物(locus specific primer)，另外2条为 SNP等位基因特异引物(allele specific primer)。

1.2.4 PCR扩增 PCR扩增反应体系为2 ×Es Taq MasterMix 7.5 μL、Primer-F(10 μmol·L-1)0.75 μL、Primer-R(10 μmol·L-1)0.75 μL、DNA 模板(100 ng·μL-1) 2.0 μL、ddH2O 4.0 μL。PCR 扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，X℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃延伸7 min，于4℃保存(X℃为最佳退火温度)。

PARMS PCR 反应体系为2× PARMS Mix 5 μL、Fa(10 μmol·L-1)0.15 μL、Fb(10 μmol·L-1)0.15 μL、R(10 μmol·L-1)0.15 μL、DNA模板(100 ng·μL-1)1 μL、ddH2O 3.55 μL。KASP PCR 反应程序：第一步：94℃变性15 min；第二步：94℃变性20 s，65℃退火1 min，共10个循环(每个循环降低 0.8℃)；第三步：94℃变性20 s，57℃退火和延伸1 min，共28个循环。

1.2.5 遗传图谱加密 将筛选后确定的InDel引物和KASP引物在F2群体中扩增并统计其带型结果，利用 Joinmap 4.0软件和MapQTL 5.0软件，采用完备区间作图法，结合HPLC测定的表型数据，对F2群体的蔗糖/葡萄糖性状重新进行QTL作图和遗传效应分析，以对数优势比(logarithm of odds, LOD)≥3确定QTL位点。

2 结果与分析

2.1 亲本材料糖含量表型特征

由图1可知，成熟南瓜果实中的可溶性糖主要为蔗糖、果糖和葡萄糖，在两亲本材料中果糖含量差异较小，蔗糖/葡萄糖差异较为显著。

图1 亲本CMO-E和CMO-97采收期果实糖组分和含量HPLC图Fig.1 HPLC of sugar components and contents in the harvested CMO-E and CMO-97 fruits

2.2 果实含糖量相关性状遗传分析

利用HPLC法对父母本、F1和F2群体的果实含糖量进行测定，结果显示，CMO-E(P1)表现为高葡萄糖低蔗糖含量，CMO-97(P2)表现为高蔗糖低葡萄糖含量。F1果实中的蔗糖、葡萄糖含量则介于两亲本之间。对F2群体的果实含糖量数据进行统计分析(图2)，发现无论是蔗糖含量还是葡萄糖含量均呈现连续的近正态分布，符合数量性状变异特征。

图2 果实葡萄糖含量、蔗糖含量在F2群体中的频数分布图Fig.2 Frequency distribution of fruit glucose and sucrose content in F2 population

2.3 蔗糖/葡萄糖QTL候选区间(qs/g19-a)分子标记开发

根据前期初定位的结果[15]，结合亲本重测序数据和南瓜的基因组信息[16]，在qs/g19-a所在的968.77 kb区间内开发50对InDel标记。利用父母本和F1对这50对引物进行初步筛选，经过PCR扩增和聚丙烯凝胶电泳检测，得到9对扩增效率高、稳定性好、条带清晰(表1)在高蔗糖/葡萄糖和低蔗糖/葡萄糖亲本间差异显著多态性良好的InDel标记(图3)。用这9对InDel引物在F2群体中进行PCR扩增，读取并统计带型结果，用于后续的遗传图谱构建(图4)。

注：从左到右依次为多态性引物S2、S5、S9、S11、S39、S40、S42、S44和S51在P1、P2和F1中的分型结果。Note: The polymorphic primers S2, S5, S9, S11, S39, S40, S42, S44 and S51 in P1, P2 and F1 are shown in the figure from left to right.图3 引物多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶图Fig.3 Primer polymorphism screening polyacrylamide gel

图4 InDel引物在部分F2单株中的扩增结果Fig.4 Results of amplification of InDel primers in partial F2 plants

表1 InDel引物名称和序列Table 1 InDel primer names and sequences

考虑到在本材料中InDel引物的有效率较低，dCAPS引物酶切成本较高等因素，故又选择了操作便捷、检测成本较低的KASP技术用于进一步的标记开发。根据前期构建遗传图谱时的SNP分子标记信息，从南瓜基因组网站下载包含这些SNP位点的基因序列，利用 SNP Primer在线引物设计软件设计引物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成。利用这6对KASP引物(表2)对F2单株进行基因分型检测，结果如图5所示。

将上述9个 InDel 标记的聚丙烯酰胺凝胶结果和6个KASP 标记的分型结果进行整理，利用Join Map 4.0和Map QTL 5.0软件将其与前期的112个SNP标记进行连锁分析，结果显示127个标记全部进入19号连锁群，蔗糖/葡萄糖相关的QTL (qs/g19-a)定位区间较之前有明显缩小，由原来的968.7 kb缩小到356.3 kb，与之紧密连锁的分子标记为Cm558和Cm588(图6)。

表2 KASP标记信息Table 2 KASP maker information

注：图中每个点对应一个F2单株，绿色具有HEX荧光基团为父本型(CMO-97)，红色具有FAMHEX荧光基团为杂合型(F1)， 蓝色具有FAM荧光基团为母本型(CMO-E)单株，灰色为阴性对照，黑色为缺失；FAM为羧基荧光素，HEX为六氯-6-羧基荧光素。Note: Each point in the figure corresponds to a single F2 plant, the green plant with HEX fluorescent group is a male type (CMO-97), the red plant with FAMHEX fluorescent group is a heterozygous type (F1), the blue plant with FAM fluorescent group is a female type (CMO-E), the gray plant is a negative control, and the black plant is missing. FAM: Carboxyfluorescein. HEX: 6-nexa-choro-Huorescein.图5 KASP标记在F2群体中的基因分型结果Fig.5 Genotyping results of KASP markers in the F2 population

注：红色为新添加标记。Note: The red markers are newly added.图6 南瓜果实蔗糖/葡萄糖的分子标记连锁图谱及定位区间候选基因Fig.6 Molecular marker linkage map of sucrose/glucose in pumpkin fruit and candidate gene for location interval

2.4 蔗糖/葡萄糖QTL位点候选基因分析

根据已经公布的南瓜基因组信息(http://cucurbitgenomics.org/search/genome/9)，对比基因注释信息发现在qs/g19-a所在的356.3 kb定位区间内共有56个基因，其中8个基因的功能是未知的。结合前人[17-18]研究进展，在剩余的48个基因中，与糖含量相关的基因共有4个：2个Fructose-1,6-bisphosphatase class 1、1个MYB 转录因子(MYB transcription factor)基因和1个Myb family transcription factor APL (Myb-like DNA-binding domain，shaqkyf class protein)基因(图6)。研究发现，果糖-1，6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase，FBP)的主要作用是通过催化果糖-1,6-二磷酸分解为果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate)和无机磷(Pi)(此过程不可逆)，参与光合作用调控糖的合成和代谢进程，是蔗糖生物合成中的调节酶之一[17-18]。此外，MYB转录因子主要是通过结合到糖酵解途径中单糖转运结构基因的启动子上，对糖的代谢过程产生影响[19-21]。因此，推测以上4个基因可能是影响中国南瓜果实甜度的候选基因。

3 讨论

果实中可溶性糖含量及其种类是影响果实风味、决定果实品质的关键[22]，成功找到控制果实糖分积累和代谢的基因对南瓜果实品质育种至关重要。随着人们消费习惯的改变，消费者对品质的追求日益凸显。近年来国内外大量学者对果实含糖量相关性状开展了一系列研究，任毅[23]对西瓜遗传图谱进行整合，得到一张包含1 339个SSR、InDel、SNP和SV标记的整合图谱，共得到60个与糖含量相关的QTL位点。结合其他相关研究发现[8, 24]，西瓜果实中的葡萄糖、果糖、蔗糖和总糖含量不仅受主效基因控制，同时也有微效基因共同起作用；陈银根[25]研究发现，黄瓜果实中的含糖量相关性状主要受加性效应的影响，其中果糖含量的最适遗传模型为1对加性-显性主基因+加性-显性多基因；甜瓜果实中含糖量遗传规律同黄瓜相似[7]，也受加性效应控制；Monforte等[26]以来自西班牙的Piel de Sapo和来自韩国的PI16137593为亲本，得到93个 F2和77个DHLs(double haploid lines)群体，并以 F2和DHLs群体为材料构建了一张包含107个分子标记、12个连锁群的遗传图谱，检测到5个和可溶性糖含量相关的QTL位点，分别命名为 ssc1.1、ssc2.1、ssc4.1、ssc4.2、ssc8.1；张宁等[27]以甜度差异显著的甜瓜亲本为材料，得到F2群体并构建遗传图谱，分别在4号和3号连锁群上得到与甜瓜果实中果糖含量相关的QTL Fru4.1和与总糖含量相关的QTL Ts3.1。本研究利用HPLC技术测定F2群体的果实含糖量，相较于传统的化学方法尽可能地降低了测定误差。对含糖量相关数据进行分析，发现南瓜果实糖含量的变化是呈连续的近正态分布，属于典型的数量性状，受环境影响较大，与上述其他葫芦科作物中关于糖的报道相一致。

对南瓜等葫芦科作物果实中含糖量相关基因的研究发现，甜瓜果实的蔗糖含量由一个单隐性基因suc决定[28-29]，CmTST2基因是在甜瓜果实发育过程中高度表达的液泡糖转运蛋白, 其过表达可以增加甜瓜果实中的糖积累，而CmS-AIV1基因则在甜瓜果实发育过程中参与调控蔗糖含量的积累[30]；在对西瓜的研究中发现了与糖转运相关的液泡膜转运蛋白基因(ClTST2)和细胞质膜转运蛋白基因(ClSWT)[9]；Li等[31]研究发现, 黄瓜蔗糖磷酸合成酶基因CsSPS4C过表达可以促进黄瓜叶片中糖分的积累。目前，还未找到决定南瓜果实含糖量基因。本研究通过分子标记的开发对遗传图谱进行了加密，缩小了蔗糖/葡萄糖这一性状的定位区间，并通过前人在白菜[18]、拟南芥[32]、马铃薯[19]等作物中的研究推测，果糖1,6-二磷酸酶和MYB转录因子影响植物发育过程中糖代谢进程的基因为蔗糖/葡萄糖性状的候选基因。缩小蔗糖/葡萄糖这一性状的QTL定位区间并对候选基因进行合理预测，为进一步明确决定中国南瓜果实甜度的基因奠定了基础。

4 结论

本研究通过南瓜果实开发和筛选分子标记，对qs/g19-a所在区间进行了遗传图谱加密，缩小了定位区间，得到了与之紧密连锁的相关分子标记，为进一步确定候选基因提供了理论依据。筛选分子标记的方法也有助于在苗期进行高糖含量南瓜幼苗的筛选，以达到节省劳动力、提高育种效率的效果。但本研究发现的QTL仅解释了糖含量的部分表型变异，还需要构建更先进的遗传群体进行研究，从而对南瓜果实中决定果实甜度的蔗糖/葡萄糖这一性状进行精细定位，进一步缩小候选区间，找到控制果实甜度的关键基因。

致谢：本研究得到了广东省省级现代产业园(汕尾市海丰县蔬菜产业园)的支持。