广西地方食用木薯种质资源遗传多样性分析

谢向誉 尚小红 严华兵,2,,* 曹 升 王 颖 肖 亮 陆柳英 曾文丹

(1 广西壮族自治区农业科学院经济作物研究所，广西 南宁 530007；2 非粮生物质酶解国家重点实验室， 广西 南宁 530007； 3广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是双子叶植物纲大戟科木薯属(Manihot)植物，耐旱抗贫瘠，广泛种植于非洲、美洲和亚洲等100余个国家或地区，与马铃薯和甘薯并列为世界三大薯类作物，是热区第三大、全球第六大粮食作物，为世界近6亿人提供粮食保障。20世纪40～50年代，木薯为华南地区重要的粮食作物，被称为“救命粮”。进入21世纪，随着人们生活水平的提高，对物质生活有了更加多样化和功能化的需求[1]。木薯不仅成为优质的工业加工原材料，更是天然健康的无公害薯类杂粮[1-2]。

近些年，国内一些科研单位通过资源收集、资源引进、杂交等方法选育了一些较好的食用木薯品种及品系，并针对不同品种的特性进行了研究与开发利用。到目前为止，我国先后选育了华南9号、 华南12号、桂热9号等食用木薯品种，近期广西壮族自治区农业科学院选育出了类胡萝卜素含量较高的面包薯1号、面包薯2号等品系，并获得了系列食用木薯中间材料。虽然我国食用木薯品种的选育及推广工作已经取得了一定的成绩，但是仍然存在种质资源丰富度差及特色优异新品种缺乏的问题，不能满足目前产业和市场发展需求。广西种植木薯已有200多年的历史，其地处中、南亚热带季风气候区，雨、热资源丰富，“立体气候”明显，生态环境多样，优越的气候条件和生态区域、长期的演化及人工选择，孕育了广西多样化的薯类作物种质资源。种质资源是品种选育的基础，种质资源遗传多样性的丰富程度是品种选育能否取得突破性进展的重要因素，种质资源的多样性研究对资源有效利用和品种选育具有重要意义[3-5]。因此，开展广西地方食用木薯资源收集及遗传多样性分析具有重要意义。

农作物种质资源收集可以丰富种质资源库的基因型[6]。广西特色薯类作物种质资源与遗传改良创新团队在第三次全国农作物种质资源普查与收集行动专项项目的支持下，系统广泛地收集了广西各地地方食用木薯种质资源，并对这些资源进行了精准鉴定评价及遗传多样性分析。遗传多样性分析可通过形态标记法和分子标记法进行。形态标记是利用植物外部特征将不同种质资源区分开[7]，直观且操作简便，被广泛应用于植物遗传多样性研究[8-11]。形态标记容易受到环境及主观因素的影响，因此结合分子标记法可以更好地反映资源的遗传背景。近年来，应用于木薯遗传多样性研究的分子标记技术主要有随机扩增多态性(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)、限制性片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism，SCoT)等[12-15]。其中，SSR具有重复性好、多态性丰富、检测方便、共显性、染色体特定位点广泛分布等特点[16-17]，已被应用于木薯[18]、马铃薯[19]、甘薯[20]等薯类作物的遗传育种研究，但鲜见对广西地方食用木薯种质资源进行遗传多样性研究的报道。因此，本研究从形态学和分子水平(SSR)对全广西收集的地方食用木薯种质资源的遗传多样性进行分析，以期为广西地方食用木薯种质资源的鉴定、遗传育种等研究提供科学依据，为我国食用木薯的创制和新品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用48份广西地方食用木薯试验材料资源(表1)，是2013—2017年在广西桂中、桂南、桂北、桂东等地收集的材料，共116份，经过调查与分析淘汰表型完全一致和氢氰酸含量高于80 mg·kg-1的资源，初步筛选出48份具有代表性的广西地方食用木薯资源，并种植于广西壮族自治区农业科学院里建科学研究基地(经度：108.27，纬度：23.17，南亚热带气候区)。160对SSR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。植物基因组DNA提取试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]、DL 2000 DNA Marker、琼脂糖、核酸染料GelRed、Ex Taq DNA聚合酶、50×TAE buffer等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 田间表型性状调查 供试材料于2017—2018年统一种植于广西壮族自治区农业科学院里建科学研究基地，每份材料种植25株，株行距为90 cm×90 cm，田间管理按照常规方法统一进行。选取中心小叶形状、株型、薯肉等41个相关性状，参考叶剑秋等[21]的方法进行调查。

1.2.2 基因组DNA的提取与检测 DNA提取参照尚小红等[22]的方法。于2017年5月中旬每份采集地方面包木薯种质资源的 6～10 个无病虫害的顶端幼嫩叶片，放于已编号的自封袋后放置于冰盒，带回实验室于-40℃保存备用。将叶片混合取样并用液氮研磨成粉末后，按照试剂盒说明书提取各材料的基因组 DNA。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度及完整性，并用 UV-2700 紫外分光光度计(日本岛津)检测其浓度，最后稀释成浓度为 50 ng·μL-1，于-40℃冰箱保存备用。

1.2.3 PCR扩增与引物筛选 从供试材料中选取形态学差异较大的样品DNA 5份，对160对SSR引物进行筛选，最终确定稳定、多态性好且带型清晰的13对引物用于扩增所有DNA。SSR-PCR扩增反应总体系为 20 μL，包含10×Buffer(含Mg2+)2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL、正反向引物各0.8 μL、Taq酶0.4 μL、木薯基因组DNA 3 μL和ddH2O 12.6 μL。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反应结束后，产物检测参考钟敏等[23]的方法。

1.3 数据统计与分析

对48份广西地方食用木薯的表型描述化数据进行数值转化处理(表2)，采用 Microsoft Office Excel 2010和 SPSS 17.0 软件进行表型性状的变异和表型Ward法聚类分析，并绘制树状聚类图。Shannon-Weaver多样性指数计算方法为H′=-ΣPilnPi，其中n为某一性状表型级别数目，Pi为某性状第i级别内材料份数占总份数的百分比，ln为自然对数[24]。根据48份食用木薯种质资源SSR-PCR扩增产物的电泳图，按同一分子量大小的DNA条带的有无进行数据统计，电泳结果的读带采取0/1方式，构建48份材料的分子标记结果的数据矩阵，并利用NTSYS-pc2.10e 软件对原始矩阵数据进行UPGMA聚类分析，构建48份广西地方食用木薯种质资源的树状聚类图。

表2 木薯描述型性状及其赋值Table 2 Code designed for descriptive characters in cassava germplasm

2 结果与分析

2.1 基于表型性状的遗传多样性分析

2.1.1 变异分析与遗传多样性指数分析 48份广西地方食用木薯种质资源的41个表型性状的变异系数(coefficient variation, CV)如表3所示，平均变异系数为37.9%；其中主茎分叉角度的变异系数最大，为86.7%，其次为块根内皮颜色、主茎表皮反面颜色、叶柄生长方向、块根形状、块根肉质颜色、薯柄长度、主茎高度、裂片叶形和嫩茎颜色。48份地方食用木薯材料平均遗传多样性指数为0.807；花与果实遗传多样性指数最小的为0，最大的为块根内皮颜色，为1.842，其次为叶柄颜色、薯柄长度、薯柄类型、块根形状、主茎分叉角度、裂片叶形、株型、主茎高度、中间裂叶长度、嫩茎颜色、叶脉颜色和单株块根数等。从变异系数和遗传多样性指数结果可知，48份地方食用木薯材料总体上表现出一定的遗传多样性，但各表型性状的多样性程度不同。

2.1.2 表型聚类分析 采用Ward法对48份材料进行聚类分析，由图1可知，以遗传距离16为阈值，材料可被分为两类(Ⅰ、Ⅱ)。Ⅰ类材料包含30份材料，对比表1的地理位置，发现Ⅰ类材料绝大多数分布在桂南、桂中和桂东，且此类材料收获指数均大于或等于0.5；Ⅱ类材料包含18份，此类材料株型均为直立或紧凑型，块根内皮颜色均为乳白色或白色，同时此类材料绝大部分分布在桂南和桂中。从材料采集分布地理位置来看(表1)，Ⅰ类材料和Ⅱ类材料没有明显的地理分布规律。

以遗传距离15为阈值，材料可被分为3类(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。Ⅰ类只有3份材料，分别分布在桂中、桂南和桂东，对比其表型调查特性发现，这3份材料株型均为伞形，裂叶叶形均为椭圆披针形，成熟主茎外皮为灰绿，株高均大于或等于300 cm(高株型)；Ⅱ类材料地理分布没有规律，但该类材料收获指数均大于0.5；Ⅲ类材料地理分布没有规律，但此类材料的株型均为直立或紧凑型，且块根内皮颜色均为乳白色或白色。

2.2 SSR多样性分析

2.2.1 分子标记多态性分析 采用13对引物对48份材料进行SSR扩增，产物分布在100～500 bp之间，共计扩增出118个较为清晰的条带(表4、图2)，平均每对引物可扩增出9.08个条带，其中多态性条带共扩增出106个，平均每对引物扩增出8.15个多态性条带，平均多态性比率达86.23%。其中，有5对引物的扩增条带多态性比率为100%。扩增结果表明，供试材料遗传多样性较为丰富。

表3 48份食用木薯材料表型性状的 变异系数及遗传多样性分析Table 3 The variation parameter and genetic diversity of traits on fourty-eight edible cassavas

图1 基于48份广西地方食用木薯资源的表型性状聚类结果Fig.1 Cluster dendrogram based on phenotypic traits of fourty-eight cassava

2.2.2 遗传相似性分析 将13对引物对48份广西地方食用木薯材料扩增条带对应的原始数据矩阵导入NTSYS-pc2.10e 软件中，分析各材料之间的遗传相似系数。48份材料的遗传相似系数范围在0.415～1.000之间。相似系数最大的材料共有7组，分别为1号与2号，30号与32号，22号与43号，10号、12号、14号与17号，9号与15号，6号、26号与35号，37号、38号与40号，每组材料之间的相似系数均为1.000，每组材料的地理分布大部分不一致；其次为19号与22号材料，2个材料的相似系数高达0.986，两者分别来自宾阳与龙州；遗传相似系数最低的材料有2组，分别为40号与23号，37号、38号与23号，遗传相似系数仅为0.415；另外，35号与23号，26号与23号，6号与23号3组材料中每组材料之间的遗传相似系数也仅为0.442；48号与20号，48号与23号2组材料中每组材料的遗传相似系数为0.449。统计后发现共有42对材料的遗传相似性系数在0.5以下。

2.2.3 基于SSR标记的聚类分析 由图3可知，在遗传相似系数为0.62处，可将48份广西地方食用木薯资源分成2个类群。第一类群(Ⅰ)包含38份材料，第二类群(Ⅱ)包含10份材料。对比资源的收集点(表1)发现，第二类群的资源有3份来自广西龙州，3份来自广西钦州浦北，1份来自广西合浦县，1份来自藤县，1份来自梧州苍梧县，推断第二类群材料为广西桂南系列材料，而第一类群材料分布无明显规律，龙州、合浦、南宁、恭城、昭平县等地，桂南、桂中、桂北地区均有分布。进一步详细划分，在遗传相似系数为0.68处，可将48份材料分成3个类群；在遗传相似系数为0.71处，可将材料分成4个类群。

注：1～48号对应表1中材料编号。Note：The corresponding numbers of number 1 to 48 are consistent with those in table 1.图2 引物C49在试验材料中的扩增结果Fig.2 Amplification results of primer C49 in experimental materials

3 讨论

3.1 广西地方食用木薯的遗传多样性

本研究在第三次全国农作物种质资源普查与收集行动的专项资助下，较为全面地对广西各市县分布的地方食用木薯资源进行了收集，从形态学和分子方面对其进行了遗传多样性分析，这对国内食用木薯的种质创制、品种改良及新品种选育等工作具有非常重要的作用。本研究通过对48份广西地方核心食用木薯种质资源的41个表型性状变异系数和多样性指数进行分析，发现48份地方食用木薯材料各性状变异系数和多样性指数的高低不完全一致，其中变异系数最大的为主茎分叉角度，其次为块根内皮颜色，而多样性指数最大的为块根内皮颜色，主茎分叉角度多样性指数仅排在第6位。主茎分叉角度变异系数高于块根内皮颜色，但块根内皮颜色的多样性指数高于主茎分叉角度，结果看似矛盾，但其实是正常的，可能导致此结果的原因主要有两方面：第一，受环境的影响，有些观察值与真值会出现偏差[25]；第二，变异系数和多样性指数是不同的两个概念，变异系数表示离散程度，系数越大，离散程度越大，而多样性指数表示多样性的丰富程度，指数越高，多样性丰富度越高。因此，材料性状的变异系数和多样性指数出现高低次序不一致的现象是正常的，这与冯章丽等[26]对荆子的研究结果一致。齐兰等[27]等采用相关序列扩增多态性标记(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)对国内外收集的134份木薯进行多样性研究，发现其平均遗传多样性指数为0.463，低于本研究48份材料的平均多样性指数(0.807)；肖鑫辉等[28]利用Shannon-Weaver方法对228份国内外木薯资源进行多样性分析，多样性指数为0.435～2.073，高于本试验材料的多样性指数(0～1.842)。说明在广西独特的自然气候条件下，经过长期的演化和自然选择，地方食用木薯资源具有一定遗传多样性。谢向誉等[9]以31份材料(国外30份材料和广西1份材料)为研究对象，发现各表型遗传多样性指数最高的为叶柄颜色，达到1.902，裂叶叶形、株型、株高、块根形状、块根内皮颜色、块根肉质颜色、单株块根数多样性指数分别为1.167、1.341、0.808、1.408、0.793、0.379、1.173，而本研究的48份材料中多样性指数最高的为块根内皮颜色，为1.842，较谢向誉等[9]研究的材料略低。但本试验材料中裂叶叶形、株型、株高、块根形状、块根内皮颜色、块根肉质颜色、单株块根数多样性指数分别为1.207、1.341、0.808、1.271、1.842、0.768、1.007，对比发现本试验材料许多性状的多样性指数较高。综上所述，本研究的48份材料广西地方核心食用木薯资源具有一定的遗传多样性，但仍需加强国内外差异性特色资源的收集与引进，以增加食用木薯育种资源的遗传多样性，从而为优良新品种的创制奠定材料基础。

表4 13对SSR引物的扩增结果及多态性信息Table 4 Amplification results and polymorphism information of 13 SSR primes

图3 48份食用木薯材料SSR分子标记的UPGMA聚类图Fig.3 UPGMA dendrogram of 48 edible cassava accessions by SSR molecular mark

SSR标记具有重复性好、多态性丰富等优点[13-14]，在木薯、马铃薯等[18-19]作物上已广泛应用。邹积鑫等[12]通过SSR标记对国内89个木薯品系分析，平均多态性水平为94.6%，而本研究对48份广西地方食用木薯进行SSR分子标记分析，多态性比率为86.23%，多态性水平较低，究其原因可能是前人研究的材料数量多、分布广，而本研究材料仅针对广西地方食用木薯材料。因此，可进一步扩大地方食用木薯资源收集的地域，如海南、广东、云南、江西等地，从而扩大我国食用木薯资源的多样性，促进优良食用木薯资源选育与利用。周建国等[29]以SRAP引物对80份木薯种质(76份木薯种质从南美、泰国和非洲引进, 4个木薯品种属于华南系列)分析，平均多态性水平为97.1%，这些材料的多态性高于本研究的广西地方食用木薯材料，同时也高于邹积鑫等[12]研究的多样性水平。由此可见本研究所收集的广西地方食用木薯资源遗传多样性总体低于国内或国外引进的木薯资源的遗传多样性，但仍有一定的丰富度。齐兰等[27]对134份木薯材料进行分析，发现材料间相似系数为0.536～0.971；薛月寒等[30]对142份选育材料和8份瑞士材料采用 EST-SSR分子标记分析，种质间的遗传相似系数均值为0.652；王明等[18]采用SSR分子标记分析195个品种(系)，遗传相似系数在0.57～0.99之间；罗霆等[31]对国内外24份木薯材料进行分析，发现其遗传相似系数在0.510～0.967 之间， 平均为0.695，而本研究对收集资源进行相似性分析，发现48份资源的遗传相似性系数在0.415～1.000之间，最低为0.415，低于前人研究材料的遗传相似性系数，说明广西地方食用木薯资源有一定的遗传丰富性。在48份地方食用木薯材料中发现遗传相似系数最低的材料有两组，分别为40号与23号，37号、38号与23号，遗传相似系数仅为0.415，表明其亲缘关系最远，在资源创制和新品种选育时，可以重点关注上述材料；另外35号与23号，26号与23号，6号与23号3组材料中每组材料之间的遗传相似系数也仅为0.442，这些研究结果对今后食用木薯种制创制等具有重要的参考意义。本研究收集的48份广西地方食用资源具有一定的遗传基础，后期加强48份材料的开发与利用，有望利用其创制更多的优良的特色食用木薯资源。

3.2 广西地方食用木薯的聚类分析

本研究对48份广西地方食用木薯资源进行了表型与分子标记聚类。通过表型聚类结果与材料收集地理分布比对发现，聚合的每一类群材料的地理来源均无规律，说明表型聚类结果与地理来源不相关。在遗传聚类的阈值为16时，48份材料被分为2类(Ⅰ、Ⅱ)，Ⅰ类材料收获指数均大于或等于0.5。由于收获指数与产量相关性较高，推断这可能与农民长期选择有关，农民期望获得较高块根产量，同时又期望地上部茎杆相对较轻，方便收获木薯时候进行茎杆的搬运；Ⅱ类材料株型均为直立或紧凑型，说明农民偏爱直立或紧凑型株型木薯，这样的木薯株型方便田间农事操作。在遗传距离阈值为15时，48份材料可分为3类材料(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。Ⅰ类材料株高较高，株型均为伞型；Ⅱ类材料收获指数均大于0.5；Ⅲ类材料株型均为直立或紧凑型。以上分类结果说明，除蒸煮等食用木薯块根的加工品质特性之外，株型、收获指数是农民选择木薯材料的主要指标，这些地方食用木薯资源是农民经过长期筛选后的材料，是我国食用木薯资源中的宝贵材料。

采用SSR分子聚类，结果表明广西地方食用木薯资源总体上没有发现与地理来源之间具有明显的关联，但部分类别材料与地理位置有关联，如在遗传相似系数为0.62处的第二类群材料大多来自桂南地区。分子聚类后广西地方食用木薯资源总体可以分为两类，第一类群包含38份材料，第二类群包含10份材料。第二类材料大多分布在广西桂南地区，为广西桂南系列材料，而第一类材料地理分布没有地理规律，桂南、桂中、桂北地区均有材料分布，造成聚类结果与地理来源上不完全一致的原因，可能是广西各地相互引种频繁导致的。通过表型聚类和SSR分子聚类对全广西收集的地方食用木薯材料进行分析，发现表型聚类和分子聚类结果不一致，这与前人许多研究结果类似，如前人采用SSR[32-33]、RAPD[14]、AFLP[13]等技术也发现，分子聚类结果与表型聚类结果不一致。

4 结论

本研究的48份广西地方食用木薯资源平均表型变异系数为37.9%，平均遗传多样性指数为0.807，多态性比率为86.23%，遗传相似性系数在0.415～1.000之间，具有较为丰富的遗传多样性，这些材料可为今后不同的育种目标提供更加广泛的食用木薯材料基础，对食用木薯种质创制、遗传改良及新品种选育具有重要意义，可促进食用木薯产业的健康快速发展。表型与分子聚类分析结果表明，表型聚类未发现类群划分与地理来源之间的关联，但与株型性状有一定的关联；在遗传相似系数为0.62时，SSR分子标记聚类为两类材料，第一类材料地理分布无规律，第二类材料大多分布在桂南。本研究结果为广西地方食用木薯资源鉴定评价和新品种选育奠定了一定的理论基础。进一步研究可对收集的地方食用木薯材料进行充分的营养品质和加工品质鉴定评价，并利用其作为亲本创制更好的优异食用木薯资源。