家畜生殖激素测定方法研究进展

张仁森，刘秋月，胡文萍，王翔宇，马 琳，储明星，狄 冉

(中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193)

生殖激素(reproductive hormone)是指与动物性器官、性细胞、性行为等的发生和发育以及发情、排卵、妊娠、分娩和泌乳等生殖活动有直接关系的激素[1]。生殖激素按其化学本质可以分为三类[2]。第一类为蛋白质、多肽类激素，垂体分泌的所有生殖激素和脑部分泌的大部分生殖激素都属此类，如褪黑素(melatonin)、催乳素(prolactin)、促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone)、促黄体素(Luteinizing Hormone，LH)和促卵泡素(follicle-stimulating hormone，FSH)。此外，胎盘和性腺以及生殖器官外的其他组织器官也可以分泌蛋白质和多肽类激素，如孕马血清促性腺激素(pregnant mare's gonadotrophin)。这类激素对性腺或乳腺的发育和分泌机能有直接作用。第二类为类固醇类激素，主要由性腺和肾上腺分泌，如生殖激素中的雌激素(estrogen)、雄激素(androgen)和孕酮(progesterone)，它们在结构上都是环戊烷多氢菲衍生物[3]，此类激素对动物性行为和FSH、LH等的分泌有直接或间接作用。第三类为脂肪酸类激素，主要由子宫、前列腺、精囊腺和某些外分泌腺体所分泌，如前列腺素(prostaglandin)，前列腺素对生殖、内分泌、心血管、呼吸、消化、神经等系统均有生物学作用，在生殖系统中起作用的前列腺素主要是PGF2α和PGE2[4]。

生殖激素对家畜的生长发育和繁殖具有重要的调控作用，因而是家畜繁殖研究中的主要对象。生理状况下动物体内生殖激素含量较低，血液中的含量一般只有10-12～10-9g/mL[5-7]，并且多数存在与其结构相似的化合物[8-10]，这些化合物的存在会干扰生殖激素的测定，造成假阳性或者假阴性，故测定的方法必须具有高度的特异性和灵敏性。通常，蛋白类的生殖激素分泌后贮存于分泌腺体中，直至需要时才从腺体中释放出来，且其在血液中不与转运蛋白结合，而类固醇类激素一般不贮存，边分泌边释放至血液中[11]。与转运蛋白结合的激素不具有生物学活性，但可以防止被肝脏分解，待解离后才具有生物学作用[12]。

家畜生殖激素的精准测定对研究其在家畜生长发育和繁殖中的调节作用具有非常重要的意义。目前国内外对其测定方法主要包括生物测定法、基于抗原抗体特异性结合的免疫分析法、基于配体受体特异性结合的测定方法、基于适配体技术的测定方法以及以液相色谱-质谱联用法(LC-MS /MS)为代表的理化测定法等五类。以上五类方法各有其优缺点，在实际应用中应根据实验目的和实际情况加以选择应用。各类检测方法优缺点总结见表1。

1 生物测定法

最早用于生殖激素浓度测定的方法是生物测定法(bioassay)，该方法是根据生殖激素的生物学作用而设计的，是研究某种新的激素及其制剂最基本的检测手段。该方法虽然灵敏度不高，但其结果能直接体现生殖激素的生物活性，因此其他方法不能替代它。

Rubin等[13]建立了一种根据子宫增重来间接判断雌激素含量的生物测定法，但是该方法复杂、费时且灵敏度较差。有人建立了一种基于放射性受体竞争结合法的体外FSH生物活性测定方法[14]。但是即使FSH能够与其受体结合，也不能完全代表激素的生物活性。其它生物测定方法还包括利用子宫增重或者阴道涂片测定雌激素、利用鸡冠发育测定雄激素[15]、利用卵巢增重测定FSH、利用抗坏血酸排空反应测定LH等技术。

生物测定法虽然可以间接反映激素的含量，但其灵敏度相对较低，并且测定的准确度和精确度受标准品纯度、生殖激素之间相似的生物活性、实验动物对激素的敏感度等因素影响，所以近年来生物测定法多用来测定生殖激素的生物活性而很少用于生殖激素浓度的测定。

表1 家畜生殖激素各类检测方法优缺点比较Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of various methods for detecting reproductive hormones in livestock

2 免疫测定法

免疫测定法是近年来得到快速发展的一种生殖激素测定方法，该方法灵敏度高，特异性好，在生殖激素的测定中得到了广泛的运用。在免疫法测定激素的历史进程中一个重要的突破是放射免疫分析法RIA(radioimmunoassay，RIA)技术的出现，该技术大大提升了激素检测的灵敏度和准确度，其发明者Yalow和Bereson[16]因此获得了诺贝尔医学奖。该方法运用I-131或者I-125作为放射信号去检测小分子量蛋白质，但是由于其放射性的危害和对环境的污染，后来又逐渐发展了酶免疫测定法(enzyme-immunoassay，EIA)、荧光免疫测定法(fluorescence immunoassay，FIA)、化学发光免疫测定法(chemiluminescene immunoassay，CL)、电化学发光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)、电化学免疫传感器法(immune- electrochemistry sensor)等免疫测定法。

Szczesna等[17]运用放射性免疫法发现绵羊血液中催乳素的浓度在怀孕的大部分阶段和怀孕前都会受到瘦素的影响，该方法灵敏度为2.0 ng/mL，批内和批间变异系数分别为9.1%和12.0%。Noguchi等[18]对猪血液中卵泡期和排卵前的促黄体素浓度进行了测定，结果发现运用荧光免疫测定法所得结果与放射性免疫测定法所得结果相似，荧光免疫测定法可以用来方便、快捷的测定猪血液中的促黄体素浓度。该方法的灵敏度为1.6 pg/mL，批内和批间变异系数分别为8.3%和6.8%。Li等[19]运用酶免疫测定法对猪卵泡颗粒细胞中的雌激素浓度进行了测定，结果显示猪卵泡颗粒细胞中雌激素的产生需要猪卵泡颗粒细胞中促卵泡素的诱导。该方法的灵敏度为0.5 pg/mL，批内和批间变异系数分别为8.3%和7.6%。董佳涵等[20]采用化学发光酶免疫分析法测定成年雌性比格犬发情期中血清促黄体素、雌二醇和孕酮的浓度水平，并与放射性免疫测定法测定结果进行比较，结果显示两者显著相关(P=0.0001)，化学发光酶免疫测定法与放射性免疫测定法检测血清促黄体素、雌二醇和孕酮浓度的相关系数分别为r=0.964、0.987、0.9997，说明可以使用化学发光酶免疫分析法代替放射性免疫测定法测定犬体内各生殖激素的含量。

免疫测定法具有高专一性、高灵敏性及操作相对简单等优点，但是其测定还是受到多种因素的影响。一是抗体的制备相对而言较为复杂。尤其对甾体类激素而言，其本身为不具有免疫活性的半抗原，故需先结合于牛血清白蛋白形成完全抗原，再制备抗体，另外甾体类激素之间具有相似的分子结构，会造成严重的交叉反应[21]。另一些因素如嗜异性抗体的存在、各种蛋白类激素类似物的存在[22]、游离激素和结合激素的平衡等因素都会影响免疫测定的结果[23]。各免疫测定法的优缺点总结见表2。

3 基于配体-受体特异性结合的测定方法

激素与其靶细胞上的受体特异性结合的亲和力很高，因此可用激素的受体代替免疫测定方法中的抗体对激素进行测定。与免疫测定法类似，用放射性同位素标记激素或其受体所建立的方法，称为放射性受体分析法(radio receptor-assay, RRA)，用酶或荧光素标记激素或其受体所建立的方法，分别称为酶标受体测定法(enzyme-labeled receptor-assay, ERA)和荧光素受体测定法(fluorescence-labeled receptor, FRA)。

夏国良等[24]利用绵羊卵巢黄体细胞膜作为LH/CG受体来源，以放射性125 I-h CG作为示踪标记配体，以高纯度hCG为标准品建立标准曲线建立了一种有效的LH-RRA测定方法。它能够直接检测多种动物血清中与受体结合的具有生物活性的LH的动态变化。该法测定程序简单，在2 h内完成并获得可重复性结果。测定方法的灵敏度为0.3 ng/管，批内和批间误差分别为(3.41±3.14)%和(8.70±7.93)%。Cheng等[25]利用草地夜蛾细胞表达的β2-肾上腺素能受体建立了一种酶标受体测定法，利用该方法所测定的克莱多巴胺的半抑制浓度(IC50)和检测限分别为30.38 μg/L和5.20 μg/L，该方法简便快速且对环境没有危害。

表2 生殖激素免疫测定方法的优缺点比较Table 2 Comparison of advantages and disadvantages of immunoassay for reproductive hormones g/mL

与免疫测定法相比，受体测定法得到的结果更接近于生物测定，因为激素只有与其受体结合后，才能表现其生物学活性。但该方法操作相对复杂，受体的制备耗时耗力，且因为激素之间结构的相似性会造成一定的假阳性。

4 基于适配体技术的测定方法

适配体(Aptamer)这一概念首次由Ellington[26]和Tuerk[27]提出。核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)从特定的DNA文库中筛选得到的一段针对靶蛋白的且具有高亲和力和特异性识别作用的单链寡核苷酸(10～100碱基)片段，又称为适配体、核酸适体或适配子等，可为ssDNA和RNA。适配体自身可通过折叠形成特定的二级或三级结构，如茎、环、凸、发卡结构、假结体、四角环和G-四链体等。

Contreras等[28]通过该技术在含1.8×1015mol单链DNA分子的随机文库中筛选出一条对孕酮具有高亲和力的核酸适配体，该适配体与孕酮的相似物17β-雌二醇(E2)和诺塞甾酮(NET)没有交叉反应，该方法检测孕酮浓度范围为10 ng/mL～60 ng/mL，检测极限为0.90 ng/mL。张桂兰等[29]建立了基于适配体技术的雌二醇纳米金比色法，该方法可在20 min内完成检测。该方法的灵敏度可达10 ng/mL，线性范围为10～10 000 ng/mL。由于长链适配体与纳米金亲和力高于短链适配体的亲和力，为了提高纳米金比色法检测雌二醇的灵敏度，Liu等[30]又将76 mer适配体剪切为33 mer和43 mer两段，建立了另外一种雌二醇的比色检测法，结果显示灵敏度提高了10倍，检测限可达1 ng/mL。

传统的抗原-抗体反应灵敏度和特异性均较好，市场上的许多试剂盒就是基于此原理开发的，但蛋白质作为探针分子易受pH、温度等环境因素影响而变性、且合成价格昂贵。适配体由DNA或RNA构成(主要是DNA)，比蛋白质体积更小，经SELEX筛选富集后，可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，同时合成更容易，稳定性更好。在不远的将来，适配体有望取代酶联免疫反应，成为各种化学分子检测的有力工具。

5 理化测定法

理化测定法中最为重要的是液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)，该方法将高分离能力、使用范围广的液相色谱分离技术(包括高效毛细管电泳、毛细管高效液相色谱等)与高灵敏、高专属的质谱技术结合起来，成为一种强有力、多用途的定性、定量分析工具，是近年来新投入应用的一种分析方法，该方法被IFCC(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)[31]推荐为测定游离甲状腺激素的标准方法，多用于检测小分子化合物，其原理是用色谱分离混合物，以质谱作为检测器，分离、检测出每种化合物的种类和浓度。

陈晓红等[32]利用该方法测定了牛奶中孕激素的残留量，检测范围为0.1～0.5 μg/kg，该方法可简便、快速的检测牛奶中孕激素的残留量且特异性强、干扰少。Jared等[33]运用该法同时检测出子宫冲洗物中783种蛋白成分。Lin等[34]运用该方法测定了羔羊和母羊卵母细胞之间5649种蛋白的表达情况，发现其中574种蛋白在羔羊和母羊之间的表达存在差异。

LC-MS相比于传统免疫方法，特异性和灵敏度更高。质谱检测技术的检测灵敏度能够达到pg/mL的水平，传统方法受制于标准曲线检测限的原因远达不到该水平。同时质谱法是通过被检测物的荷质比进行精确定量的，因此特异性更好，准确性更高。在进行生殖激素水平检测时，由于该类物质在动物机体内浓度都相对较低，且结构相似的物质较多，传统免疫方法和高效液相色谱法的敏感性和特异性均无法达到检测要求[35]。LC-MS操作流程相对复杂且实验设备昂贵，故目前尚未普及。