外泌体介导运动干预阿尔茨海默病的研究进展

邝程斌，夏 杰，吴 珊，徐 波*

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD），又称老年性痴呆，是一种记忆和认知功能进行性丧失的神经退行性疾病。其主要病理特征表现为，过度产生β-淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）在细胞外沉积形成的老年斑，过度磷酸化tau蛋白引起的神经元纤维缠结，以及突触功能障碍、神经炎症反应、神经发生数量减少和氧化应激损伤（Long et al.，2019）。

体内所有细胞几乎都能分泌外泌体（exosomes，EXs）。EXs携带活性蛋白、非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）和信使RNA（messenger RNA，mRNA）等多种细胞生物成分，能穿梭血脑屏障（BBB）且难被降解，广泛参与细胞的成分交换和信号转导，被誉为细胞间的第三信使（Colombo et al.，2014）。EXs还参与神经系统信号网络调节，具有改善神经性疾病的作用；间充质干细胞EXs（MSCs-EXs）能抑制脑部神经炎症，促进神经发生，改善神经功能（Zhang et al.，2016）。近年来，EXs与AD逐渐成为生物医学领域的研究热点。EXs具有减少Aβ生成（Yang et al.，2019）、抑制过度磷酸化tau蛋白集聚（Wang et al.，2019）、增加突触可塑性（Micci et al.，2019）、促进神经发生（Reza-Zaldivar et al.，2019）、抑制神经炎症（Cui et al.，2019）、减轻氧化应激（徐会友等，2019）等延缓和改善AD的效应。AD患者中存在EXs数量减少（Bertoldi et al.，2018；Yuyama et al.，2015）以及携带成分改变的病理现象（Goetzl et al.，2016；Lugli et al.，2015；Suire et al.，2017），提示EXs异常是AD的病理机制之一。因此，深入探究EXs与AD的生物机制，可为AD的诊断和防治提供新方向。

运动可减少AD脑内Aβ沉积和过度磷酸化tau蛋白积聚（Dong et al.，2018；Herring et al.，2016），促进神经发生和提高突触可塑性（Lin et al.，2012），抑制神经炎症和减轻氧化应激（Leem et al.，2009），提高认知功能（Cosin-Tomas et al.，2014；Khodadadi et al.，2018）。近期研究以EXs为靶点，发现运动、EXs、AD三者间有生物学机制联系：运动能促进EXs生成并调节其内在成分，进而介导多种健康效应，改善AD。因此，EXs是运动干预AD的新机制。

1 EXs组成及功能概述

EXs直径为40～150 nm，密度为1.10～1.18 g/mL，电镜下呈双凹碟形或杯状，可由内体分选转运复合物（ESCRT）通过质膜内陷形成早期内体再出芽形成含有管腔内囊泡（ILVs）的多泡体（MVBs）。MVBs与膜融合后以胞吐的方式将ILVs释放到细胞外基间质，形成具有生物活性的EXs；或由非ESCRT机制通过中性磷脂与细胞膜上结合生成神经酰胺等脂类，诱导细胞内体限制性膜内陷形成ILVs，再出胞形成EXs。EXs膜上有免疫功能相关分子鞘脂糖（glycosphingolipid，GSL）、朊蛋白（prion protein，PrPc）等多种膜结合蛋白，膜内含有脂质、蛋白质、核酸、细胞因子、转录因子等多种物质，能以自分泌、旁分泌或激素样分泌的方式通过跨膜蛋白或脂质配体与靶细胞膜上受体结合，特异性受体与受体细胞膜绑定，受体细胞通过内吞和膜融合等被受体细胞吸收，实现细胞之间的通信。EXs具有穿梭性、载体性和疾病预测等功能，用特异性标志物Alix蛋白、Tsg101等可检测EXs的存在（He et al.，2018）。

外泌体广泛存在于血液、尿液、唾液、脑脊液等体液中。EXs是中枢神经系统（CNS）的重要通信介质，机体通过分泌、结合和摄取EXs等生理过程调节神经元内环境，表明EXs参与AD等神经性疾病的发生发展。

2 EXs与AD的关系

2.1 EXs与Aβ

正常情况下，Aβ的产生和降解处于动态平衡状态。病理条件下，Aβ沉积会引起神经炎症、突触障碍等病理，引发AD。Yuyama等（2015）研究发现，老年食蟹猴和AD小鼠脑脊液EXs（CSF-EXs）的数量降低，结合Aβ的CSFEXs数量显著降低，提示EXs参与Aβ代谢。研究表明，随着小鼠脑神经瘤细胞EXs（N2a-EXs）的浓度增高，AD小鼠海马脑室区Aβ38、Aβ40、Aβ42的数量减少，突触灵活性增强（吴焕成等，2015）。此外，骨髓间充质干细胞EXs（BMMSCs-EXs）能减少AD小鼠脑内Aβ沉积，并增加神经突触棘数量（Elia et al.，2019）。这些研究说明，EXs有助于Aβ病理的改善。

EXs膜表面的功能分子参与Aβ病理调节。PrPc是EXs表面的免疫功能因子之一，脑脊液的EXs通过PrPc阻止神经元与Aβ结合，阻断Aβ诱导的突触功能失调（An et al.，2013）。结构分析发现，PrPc的N-末端可与Aβ42紧密结合，具有高度结合五聚体Aβ、二聚体Aβ和寡聚体Aβ的能力，加速Aβ纤维化，减轻寡聚体Aβ的神经毒性（Jarosz-Griffiths et al.，2016）。提示EXs的PrPc可将Aβ分解在EXs膜表面，避免它在神经元表面堆积。GSL是EXs膜表面的另一种免疫相关分子。神经元EXs的GSL可将Aβ运输至小胶质细胞降解，显著降低AD小鼠海马Aβ水平（Yuyama et al.，2014）。这些研究提示，EXs表面携带的GSL和PrPc，可成为清除Aβ的有效手段。另一清除Aβ的途径是，EXs将脑内Aβ转运至外周，降低AD脑内Aβ浓度。Fiandaca等（2015）研究发现，与正常人相比，AD病人和额颞叶痴呆（FTD）患者血清中神经元源EXs结合Aβ和过度磷酸化tau蛋白的数量显著增加。上述研究说明，增加AD脑内EXs的数量会增强EXs清除Aβ的能力。

脑啡肽酶（neprilysin，NEP）是Aβ的降解酶之一。脂肪间充质干细胞EXs（ADSCs-EXs）携带的活性NEP能显著降低 Aβ水平（Katsuda et al.，2013）。微小 RNA（microRNA，miRNA）能负调节基因表达，调控细胞生理功能。Micci等（2019）表明，海马干细胞 EXs（NSC-EXs）能显著减少Aβ与突触的结合数量，携带miR-485、miR-17、miR-322的神经元EXs可抵抗Aβ造成的突触损伤，逆转Aβ导致的记忆障碍。胰岛素降解酶（insulin degrading enzyme，IDE）是一种Aβ降解酶。Yang等（2019）发现，人脐带间充质干 细胞 EXs（hucMSC-EXs）携带 NEP、IDE 和 HSP70（heat shock protein 70，HSP70）等195种细胞功能分子。这些功能分子通过上调脑内α-分泌酶（α-secretase）表达，下调β-分泌酶（β-secretase）表达，抑制Aβ产生。上述研究表明，EXs携带的功能分子能抑制Aβ产生并降解Aβ。

EXs膜表面的免疫分子能降低Aβ浓度，携带的功能分子能抑制Aβ产生和促进Aβ降解。未来可进一步分析血清EXs中Aβ、tau蛋白等生物分子能否成为诊断AD的生物标志物，并从EXs中筛选出Aβ代谢平衡的功能分子。

2.2 EXs与tau蛋白

tau蛋白与AD进行性认知功能下降及神经元丢失直接相关。EXs参与胞内tau蛋白分泌。在tau蛋白细胞模型中，包含AD早期tau蛋白标志物的AT270能以EXs形式分泌出胞，表明EXs参与tau蛋白病理调节（Saman et al.，2012）。大鼠皮层神经元去极化时释放含有tau蛋白的EXs能被神经元和小胶质细胞吸收（Wang et al.，2017），说明EXs降低神经元中tau蛋白浓度的方式是通过转运胞内tau蛋白以及将tau蛋白运输到小胶质细胞和其他神经元。进一步研究发现，在tau蛋白转基因的AD小鼠模型中，含有过度磷酸化tau蛋白的EXs先被小胶质细胞吞噬，再降解（Asai et al.，2015）。如上所述，EXs是小胶质细胞清除细胞内和细胞间过度磷酸化tau蛋白的重要载体，提高神经内环境EXs的浓度有利于缓解AD的tau蛋白病理。

糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）是tau蛋白过度磷酸化的主要激酶。Wang等（2019）研究表明，姜黄素诱导巨噬细胞分泌的EXs（Cur-EXs）能激活海马神经元蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号，抑制AD脑内GSK-3β的活化以及tau蛋白的过度磷酸化，提示EXs可能携带有利于tau蛋白代谢稳定的有益成分。进一步发现，MSCs-EXs携带的miR-1792可上调磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidy linositol 3-kinase，PI3K）-AKT-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号，抑制GSK-3β激活，促进轴突再生，表明miR-1792的EXs能通过抑制GSK-3β激活进而抑制磷酸化tau蛋白生成（Feliciano et al.，2014）。过表达miR-132/miR-212可增强AD小鼠脑中Aβ、过度磷酸化tau蛋白的自噬能力（Hernandez-Rapp et al.，2016）。研究发现，MSCs-EXs含有miR-132/miR-212（Yang et al.，2018），提示携带miR-132/miR-212的MSCs-EXs可通过增强细胞自噬能力，减少Aβ和过度磷酸化tau蛋白数量。研究说明，EXs携带的miR-1792、miR-132/miR-212等有益成分，通过调节细胞信号和自噬功能，缓解AD脑内的tau蛋白病理。

EXs转运tau蛋白的方式和携带的有益成分能抑制AD脑内过度磷酸化tau蛋白的产生和聚集。然而，过度磷酸化tau蛋白被分选到EXs的过程仍不清楚。

2.3 EXs与神经发生

神经发生数量与AD患者Braak病理分期直接相关，神经发生数量的减少会加速AD的发生发展。EXs具有促进神经发生的作用。研究发现，人类诱导多功能干细胞EXs（hiPSC-EXs）能上调小鼠海马齿状回颗粒细胞层（dentate gyrus cell，DGC）神经发生标记物DAPI、Nestin和EdU＋的表达（Sharma et al.，2019）。Reza-Zaldivar等（2019）实验表明，在AD小鼠脑内连续4周注入MSCs-EXs，发现AD小鼠海马脑室下区（subventricular zone，SVZ）神经发生标记物DCX＋的表达显著提高。研究表明，具有促进神经发生作用的EXs是干预AD的策略之一。

EXs促进神经发生的途径之一是激活Wnt/β-catenin信号通路（Wnt/β-catenin pathway）。研究表明，携带Wnt蛋白的EXs能激活果蝇发育期细胞和人类细胞的Wnt/βcatenin信号，促进细胞增殖（Gross et al.，2012）。在AD小鼠脑中过表达Wnt3a，发现Wnt/β-catenin信号激活后，DGC神经发生数量显著增加（Shruster et al.，2014）。BMMSCs-EXs含有 Wnt3a蛋白，能激活 Wnt/β-catenin信号，促进成纤维细胞增殖（McBride et al.，2017）。研究说明，EXs能通过激活Wnt/β-catenin信号，促进AD脑内神经发生。

EXs促进神经发生的另一途径是激活AKT信号。Feliciano等（2014）研究发现，健康人类和啮齿类动物胚胎脑脊液中含有 miR-124、miR-25b、miR-17-5、miR-92b、miR-93、miR-92a、miR-181、miR-99b和 Let-7的 EXs，能通过激活胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGF）-PI3K-AKT-雷帕霉素复合物1（mTORC1）信号，提高神经发生标记物DAPI、Nestin的表达数量，增加神经元密度。研究发现，携带miR-21的神经元前体细胞EXs（NPCEXs）能促进细胞神经发生（Ma et al.，2019），机制是miR-21能通过抑制程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4），同时激活 PI3K-AKT 信号抑制AD脑内神经凋亡，促进神经发生（Feng et al.，2018）。说明，EXs激活AKT信号能提高AD脑内神经发生的数量。

2.4 EXs与突触可塑性

突触受体损伤及突触可塑性降低造成的突触功能障碍是导致AD认知障碍的重要因素（Hu et al.，2017）。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）能促进神经发生和增加突触可塑性。Suire等（2017）研究发现，老年人群血清神经元EXs携带的BDNF数量显著减少，BDNF前体（pro-BDNF）数量则显著增加。Goetzl等（2016）实验检测到AD和FTD患者血清EXs中SYP、突触足蛋白（synaptopodin，SYNPO）和突触结合蛋白相关基因2（synaptotagmin-2，SRG2）等突触相关蛋白的数量显著降低。实验证实，与健康人群相比，AD患者血清神经元EXs的突触体相关蛋白25（synaptosomal-associated-protein-25，SNAP25）数量显著降低（Agliardi et al.，2019）。研究表明，EXs传递BDNF等突触营养蛋白的能力受损是AD突触障碍的重要诱因，恢复EXs的正常传递功能是改善AD脑内突触功能的有效手段。

一方面，EXs能抑制突触受体损伤。兴奋性氨基酸转运蛋白2（excitatory amino acid transporters 2，EAAT2）是减缓AD脑内谷氨酸（glutamic acid，Glu）受体持续激活的载体之一。研究发现，神经元型EXs携带的miR-124通过提高星形胶质细胞EAAT2蛋白水平，抑制突触后膜Glu受体的持续激活，保护突触受体正常活性（Morel et al.，2013）。Aβ会降解突触酪氨酸激酶Eph受体B2（Ephrin receptor B2，EphB2），造成EphB2与神经元膜Eph受体结合量显著降低，导致突触数量减少，恢复AD小鼠脑内的EphB2表达，逆转Aβ导致的突触数量减少（Hu et al.，2017）。研究表明，携带EphB2的EXs能在神经元去极化时释放，调节突触后膜受体活性，增加神经元之间的突触连接数量（Gong et al.，2016）。这表明，携带miR-124和EphB2的EXs能抑制AD脑内的Glu和Eph突触受体损伤。

另一方面，EXs能增加突触可塑性。携带突触蛋白1（synapsin-1，SYP-1）和微管蛋白 2（microtubule associated protein 2，MAP2）的hiPSC-EXs能显著增加神经元突触密度（Sharma et al.，2019）。携带突触素I（synapsin I，SYN-I）的少突胶质细胞EXs能提高海马神经细胞粘附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）的表达，促进神经突触增长（Wang et al.，2011）。研究发现，神经元去极化时分泌携带微管蛋白1B（MAP1b）、miR-638、miR-149的EXs能正向调节突触可塑性（Goldie et al.，2014）。结果表明，携带突触蛋白和miRNA等活性物质的EXs能增加突触可塑性。

2.5 EXs与神经炎症

小胶质细胞和星胶质细胞过度活化释放的炎症因子是造成AD神经炎症损伤的主要因素（Cui et al.，2018）。研究发现，AD患者中携带HSP70的EXs数量显著低于正常人（Goetzl et al.，2015），而携带 HSP70的 EXs是α1-肾上腺素能受体（α1-adrenoceptor，α1-AR）为减轻应激状态下机体炎症的重要反馈调节物质（Beninson et al.，2014），提示AD患者机体内携带HSP70等活性分子的EXs在抑制机体炎症过程中功能弱化，造成外周系统炎症和中枢神经系统炎症相互影响，加重AD的发生发展。

EXs能抑制AD脑内小胶质细胞和星胶质细胞过度活化与炎症因子表达。Wang等（2019）发现，外周注射巨噬细胞EXs能下调AD小鼠脑内小胶质细胞阳性活化标志物离子化钙结合衔接子分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba-1）表达。Cui等（2019）实验证明，BMMSCs-EXs能下调AD小鼠脑内肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6的表达，上调抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表达，减少星形胶质细胞活化标记物胶质原纤维酸性蛋白（glial fibillary acidic protein，GFAP）产生。Cui等（2018）还发现，MSCs-EXs能抑制转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）和核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路的激活，降低TNF-α和IL-1β表达，提高IL-4和IL-10表达，减少AD小鼠脑中星胶质和小胶质细胞的过度活化。研究提示，EXs可能是抑制AD脑神经炎症的新途径。

携带活性分子的EXs是抑制AD脑内胶质细胞激活和炎症因子生成的关键因素。携带miR-30d-5p的EXs能抑制小胶质细胞M1炎性活化，促进小鼠脑内M1向M2非炎性转化（Jiang et al.，2018）。研究发现，miR-146a通过抑制白细胞介素-1受体相关激酶（IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK-1）、IRAK-2、肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TNF receptor associated factor 6，TRAF-6）、IL-1β等炎症因子的表达，改善AD神经炎症（Iyer et al.，2012），提示携带miR-146a的EXs能抑制AD神经炎症。人胚肾细胞携带miR-146a的EXs能通过调控Toll样受体4（tolllike receptor 4，TLR4）信号通路，抑制小胶质细胞炎性反应，减少干扰素-β（interferon β，IFN-β）、TRAF-6、TNF-α、IL-1β的表达（杨永祥 等，2018）。携带miR-146a的BMMSCs-EXs能抑制糖尿病大鼠脑内的星胶质细胞炎症（Kubota et al.，2018）。研究表明，携带miR-30d-5p等活性分子的EXs是抑制AD脑内神经炎症的潜在靶点。

2.6 EXs与氧化应激

活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起的氧化应激（oxidative stress，OS）能导致Aβ沉积和过度磷酸化tau蛋白聚集。ROS和Aβ之间的恶性循环会加速AD病理，减轻氧化应激能减缓AD患者神经元损伤。

EXs能抵抗氧化应激引起的神经损伤。研究表明，NSC-EXs能抑制氧化应激所致的神经元凋亡，显著提高神经元活力（黎博等，2018）。

过量活性氧会增加线粒体通透性，降低膜电位，导致线粒体外膜破损，释放出凋亡因子Caspase3和Bax，诱导细胞凋亡，加重AD病理（Sorrentino et al.，2017）。研究表明，少突胶质细胞EXs能防止神经元线粒体膜电位破坏，抵抗过氧化氢引起的氧化应激对神经元的损伤，抑制神经元凋亡，提高神经元存活能力（Fruhbeis et al.，2013）。ADSCs-EXs能降低脑组织中线粒体Caspase3和Bax的表达，抑制神经元凋亡（Chang et al.，2019）。研究说明，EXs能保护线粒体结构，抵抗AD脑内氧化应激。

Aβ会降低超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等抗氧化酶（antioxidant enzyme）的活性和数量，导致活性氧过度积累和氧化应激产生。研究发现，少突胶质细胞分泌的EXs可携带SOD、CAT和其他抗氧化酶，减轻氧化应激所致的神经元凋亡（Frohlich et al.，2014）。星胶质细胞分泌的EXs可转运GSH、SOD和CAT等抗氧化酶，提高神经元抗氧化能力（Ranjit et al.，2018）。外周组织也能分泌含有抗氧化酶的EXs。徐会友等（2019）研究发现，含有 SOD 的 MSCs-EXs、BDNF刺激MSCs-EXs携带的高活性SOD，均能减轻氧化应激造成的神经元损伤。研究表明，EXs能通过提高AD脑内的抗氧化能力抵抗氧化应激。

3 EXs介导运动干预AD的作用机制

多数研究证明，EXs是运动应激下机体内分泌、旁分泌和自分泌的适应性调节产物。长期运动人群的血浆EXs数量显著增加（Hou et al.，2019）。30%～80%最大摄氧量（V.O2max）运动负荷下，血液中EXs的数量会急剧增加（Whitham et al.，2018）。Hou等（2019）发现，4周递增负荷的游泳运动能诱导大鼠肝、内皮、肌细胞分泌EXs。人体实验表明，一次耐力运动后，血小板型EXs是运动前的2.9倍，骨骼肌EXs的标记蛋白ALIX会急剧下降，循环系统中EXs的数量会随耐力运动的时间增加而增加（Safdar et al.，2016）。3分钟的递增负荷运动能促进循环中淋巴细胞、单核细胞、血小板、内皮细胞等免疫细胞释放EXs（Brahmer et al.，2019）。研究表明，单次、长期、急性、慢性运动均会促进机体分泌EXs，提高循环EXs的水平。

3.1 EXs清除代谢废物介导运动干预AD

运动期间EXs分泌和释放是清除机体代谢废物的方式之一。Fruhbeis等（2015）发现，EXs在运动初级阶段就已分泌，速度快于肾上腺素（adrenaline，epinephrine，AE）和去甲肾上腺素（norepinephrine，INN）的释放，进入循环系统的EXs能处理细胞压力状态下产生的代谢废物，维持细胞内环境代谢平衡。研究表明，人体进行20 min的有氧运动后，汗液EXs有1 062种蛋白质发生变化，包括代谢产物、免疫因子等997种从未在汗液中报到过的分子，运动期间的EXs能将包裹的代谢废物通过汗腺排除体外（Wu et al.，2018）。另研究表明，一次性递增负荷跑台运动产生的EXs会随血液循环穿梭到大脑、肝脏等全身组织，90～180 min后逐渐恢复到安静水平（Fruhbeis et al.，2015）。运动能促进细胞代谢废物通过EXs途径清除，防止代谢废物聚集诱导的细胞损伤。

运动改善脑健康作用与EXs的数量增加有关。EXs参与细胞内Aβ、tau等代谢废物的处理过程，AD脑内致病性蛋白集聚的部分原因是神经元细胞废物处理功能弱化，增加脑内EXs数量有利于降低AD脑内的Aβ和过度磷酸化tau蛋白浓度。运动减少AD脑内神经元代谢废物Aβ数量与脑内EXs分泌和释放有关。EXs释放受自噬相关基因 5（autophagy related gene 5，Atg5）调控，上调 Atg5表达可调节MVBs生成进而增加EXs的数量，敲除Atg5基因，效果消失（Guo et al.，2017）。Herring等（2016）发现，5个月跑轮运动显著上调1月龄和7月龄AD小鼠大脑皮层与海马中的Atg5表达，并减少Aβ沉积数量。另有实验表明，5个月的有氧运动训练能显著提高AD小鼠脑内MVBs的水平，认为运动可能促进脑内EXs的产生和释放（Zhang et al.，2018）。这些研究表明，运动可能通过上调Atg5表达和提高MVBs水平，诱发脑内神经元型EXs分泌，改善Aβ等病理。另外，运动减少脑内Aβ数量还与外周EXs的数量增加有关。Bertoldi等（2018）表明，与安静组相比，21月龄的衰老大鼠进行2周跑台训练后的循环EXs数量增加，携带神经元型Aβ的EXs数量增加，EXs携带的神经突触标记物乙酰胆碱酯酶（cholinesterase，AChE）数量显著下降。研究证实，小鼠经过持续4周的有氧跑台运动，血浆和脑组织中的内皮祖细胞型EXs（EPCEXs）显著增加，且运动组小鼠血浆EPC-EXs和脑组织中的EPC-EXs水平升高呈正相关，脑组织中EPC-EXs的水平与caspase-3表达、神经细胞凋亡数量呈负相关（Wang et al.，2020）。研究表明，运动期间的EXs能快速通过血脑屏障，引起脑内EXs数量增加，并将脑内神经元型Aβ转运至外周组织降解或者通过其他方式排出体外，利于机体清除神经元Aβ等代谢废物，恢复神经突触功能。

运动引起脑内EXs的变化是运动改善AD脑健康的重要作用机制。因此，EXs清除代谢废物的作用是运动干预AD的机制之一。然而，运动促使EXs释放的过程仍不明晰，未来应探究运动强度、运动方式、运动类型、运动时间引起的EXs变化，及其与AD之间的关系。

3.2 EXs携带运动因子介导运动干预AD

运动诱导骨骼肌和其他组织器官产生肽类或核酸类成分的物质称为运动因子（exerkines）。研究表明，肌纤维分泌的437种蛋白质，65.3%存在于EXs中（Pedersen et al.，2012）。Whitham等（2018）发现，运动会调节循环EXs中的322种蛋白。Bryl-Gorecka等（2018）实验表明，运动后CD62型EXs包含的54种蛋白质发生显著变化，低、中和高强度跑步训练会调节EXs中miR-128-3p、miR-103-3p、miR-330-5p、miR-148a-3p、miR-191a-5p、miR-10b-5p、miR-93-5p、miR-25-3p的表达（Oliveira et al.，2018）。一次性高强度间歇性自行车运动可显著增加循环EXs中miR-1-3p、miR-16-5p和 miR-222-3p的数量（D'Souza et al.，2018）。研究认为，EXs是运动期间运动因子调控机体生理状态的重要载体，运动能促进EXs生成并使其携带具有生物活性的运动因子，包括骨骼肌分泌的鸢尾素（irisin）、BDNF等肌肉因子（myokines），肝脏分泌的成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF-2）、IGF等肝细胞因子（hepatokines），脂肪组织分泌的瘦素（leptin，LP）、脂联素（adiponectin，ADPN）等脂肪因子（adipokines），以及其他组织分泌的运动因子。这些进入循环系统的运动因子包装在EXs内，会在大脑、心脏、血管和脂肪等组织进行近端以及远端作用，进而调节神经、免疫、心血管和代谢系统的生理活动（Kim et al.，2019）。对20名健康受试者进行10 min的自行车锻炼并逐渐增加运动强度，1 h后机体EXs数量显著减少，说明运动会促进EXs分泌和机体组织摄取EXs（Bryl-Gorecka et al.，2018）。以上研究说明，携带运动因子的EXs参与运动条件下机体细胞间的通信。

EXs携带的活性物质运动因子是运动应激下机体适应性成分。运动产生的运动因子之所以被组装在EXs中，是因为细胞外环境不是运动因子的适宜环境。由于EXs的特殊结构，运动因子能免受如核糖核酸酶等降解，长距离、长时间、多途径转递，介导运动在生理与病理方面产生广泛的健康促进效应（Li et al.，2019）。Hou等（2019）证明，长期运动人群血液EXs中的miR-342-5p数量显著增加，并通过靶向Caspase 9和c-Jun氨基末端激酶2（c-jun n-terminal kinase，Jnk2）以及蛋白磷酸酶 1（protein phosphatase 1F，PPM1F），上调Akt信号，保护心脏免受心肌缺血/再灌注损伤。

小鼠咬肌收缩会分泌NEP的EXs到海马神经元，引起海马NEP数量增多（Kobayashi et al.，2019）。Khodadadi等（2018）发现，4周跑台运动能增加AD大鼠脑内的IDE和NEP数量，减少Aβ沉积。运动引起肌肉收缩能促进NEP和IDE的表达与EXs释放，且NEP和IDE被包裹在EXs中，说明运动能通过EXs增加NEP、IDE水平，减少AD大脑Aβ的集聚。Dong等（2018）实验表明，4周跑轮运动能上调AD小鼠脑内miR-132的表达，显著降低海马Aβ的水平。miR-132可提高Aβ、过度磷酸化tau蛋白的自噬能力和在EXs中的表达。运动能提高miR-132的表达及增加EXs数量，EXs能分选miR-132，说明运动通过EXs增加脑内miR-132的数量，提高AD脑内Aβ和过度磷酸化tau蛋白的自噬能力。而且，EXs能携带组织蛋白酶B（cathepsin B，CTSB）（Downs et al.，2018）。Moon等（2016）研究表明，8周跑台运动可显著提高恒河猴和人类血浆中的CTSB水平并促进神经发生，12周跑台训练能上调大鼠海马中Wnt3a的表达，激活Wnt信号，促进神经发生（Lee et al.，2019）。运动能增加脑内CTSB、Wnt3a和EXs数量，EXs能组装CTSB和Wnt3a蛋白，表明运动可通过EXs增加脑内的CTSB和Wnt3a蛋白数量，促进AD脑神经发生。2周低强度和高强度跑台运动能增加大鼠海马神经元miR-124数量，增强突触可塑性（Mojtahedi et al.，2013）。EXs的miR-124能抑制AD突触受体毒性，运动能提高脑内miR-124和EXs数量，且EXs包含miR-124，说明运动能通过EXs增加AD脑内miR-124数量。Choi等（2018）发现，6周跑台运动能上调AD小鼠海马BDNF和SYP的表达，促进神经发生和突触生长。Lin等（2012）发现，4周跑台运动能上调大鼠海马SNAP-25的表达，提高海马树突棘密度。运动能增加BDNF、SYP、SNAP-25和EXs数量，BDNF、SYP、SNAP-25均能在EXs中表达，提示运动能通过EXs提高AD脑内BDNF、SYP、SNAP-25的表达水平，促进神经发生，增加突触可塑性。Leem等（2009）发现，5周跑台运动能增加AD小鼠脑中的SOD和CAT等抗氧化酶数量，减轻神经氧化应激。运动能增加EXs和SOD、CAT数量，SOD和CAT可在EXs中表达，说明运动通过EXs增加AD脑内的SOD、CAT等抗氧化酶数量，以减轻AD的氧化应激。研究表明，运动对AD的病理调控作用可能与运动期间携带运动因子的EXs有关。

运动通过调节EXs中运动因子的表达，产生神经保护作用进而干预AD。AD的发病机制与EXs携带运动因子异常变化有关。Lugli等（2015）发现，AD患者血清中EXs的miR-342-5p显著减少。研究表明，运动能上调EXs中miR-342-5p的表达（Hou et al.，2019）。另Suire等（2017）发现，运动能力较好的老年人群中，血清神经元型EXs携带的BDNF数量显著增加，提示运动会提高AD患者EXs携带的miR-342-5p和BDNF数量，改善AD相关病理。BMSCs和ADSCs等MSCs分泌的EXs能显著改善AD病理特征。MSCs是分化成肌肉、骨骼和脂肪的共同细胞源，运动能影响MSCs生理状态及调节MSCs-EXs的内在成分。研究发现，9周运动训练能提高大鼠ADSCs神经元标记蛋nestin、β-tubulin、MAP2的表达和神经突起长度，表明运动有促进ADSCs分化为神经元的潜力（Kato et al.，2019）。Kubota等（2018）发现，在装有自主跑轮的丰富环境干预下，链脲佐菌素（STZ）型认知障碍大鼠BMMSC会显著增加含有miR-146a型运动因子的EXs数量，减轻海马神经元和星形胶质细胞的炎症反应，改善大鼠认知障碍。研究说明，运动能通过调节MSCs-EXs分泌及成分，增强机体抵抗AD病变的能力。此外，运动还能调节内皮祖细胞型EXs（EPC-EXs）的组成成分。Wang等（2020）证据显示，中等强度的跑台运动可增加小鼠脑组织中携带miR-126型运动因子的EPC-EXs数量，提高神经发生标记物BrdU+和NeuN+的数量，促进脑血管生成，抑制缺氧诱导的神经元凋亡，增强受损轴突生长的能力，提高小鼠认知能力。体外细胞模型还发现，阻断miR-126型EPC-EXs作用，运动产生的神经元保护效应消失。研究表明，运动能促使EXs携带如miR-146a型运动因子，并使EXs成为具有缓解和改善AD的“运动药丸”。这为EXs-exerkines途径介导运动干预AD提供了有力证明。

运动改善AD的病理作用至少部分与运动期间EXs的运动因子有关。因此，EXs携带的运动因子是介导运动干预AD的机制之一。然而，目前尚不清楚运动促使何种组织释放EXs并调节何种运动因子，有待进一步研究。

3.3 EXs提高机体整合效应介导运动干预AD

EXs是中枢-外周、细胞-组织-器官-系统交流的共通路径，能在机体各组织中转移其携带的物质，在调控人体庞大复杂系统、协调机体整体稳定性方面发挥重要作用。Li等（2019）认为，运动作为机体的良性刺激，几乎对所有器官均有健康促进效应，发挥延缓机体衰老，改善神经系统、心血管和代谢性疾病等整合效应，EXs则是运动发挥整合效应促进机体健康的共通路径。

运动通过EXs缓解AD外周系统的病理症状。血管功能障碍和胰岛素抵抗会加速AD发展，改善血管功能和胰岛素抵抗能延缓AD病程（Love et al.，2016）。研究表明，运动会促进机体释放携带miR-126的EPC-EXs，通过上调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，下调萌芽相关蛋白1（sprouty-related protein-1，SPRED1）的表达，提高血管内皮细胞的血管修复和生成能力（Ma et al.，2018）。耐力运动能促使机体分泌携带HSP60的EXs，提高骨骼肌等组织中过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α，PGC1α）的表达，改善机体胰岛素抵抗（Safdar et al.，2018）。此外，携带HSP70的EXs能抑制AD机体的炎症因子。Fruhbeis等（2015）发现，人体运动期间会释放携带HSP70的EXs进入循环系统，提示运动可通过EXs增加组织中HSP70的数量，防止外周组织的炎症因子进入脑部，或者直接在脑内发挥抗炎作用。这些研究说明，具有整合效应的EXs是运动改善血管功能障碍、缓解胰岛素抵抗和抑制机体炎症的信使载体，运动期间的EXs可在肌肉血管等近端组织发挥作用，通过缓解AD患者机体外周系统疾病病理，间接改善脑内神经病变，降低AD患病风险。

运动通过EXs直接改善中枢神经系统的神经病变。骨骼肌EXs可直接作用于神经，增强神经突触可塑性和抑制神经元凋亡（Madison et al.，2014）。AD患者脑脊液中，miR-9显著减少（Riancho et al.，2017），而miR-9能负调节β-分泌酶表达（Choi et al.，2019）。研究发现，6个月有氧运动能显著增加外周循环携带miR-9的EXs数量，增加前额叶皮层（PFC）、前扣带回皮层（ACC）灰质体积，显著提高MCI患者学习记忆能力（Anderson-Hanley et al.，2018）。这表明运动会通过增加外周循环中携带miR-9的EXs数量，减少脑内Aβ生成，阻止AD发展。研究发现，富集环境（含自主跑轮）干预下，正常和衰老动物模型血清中携带miR-219的EXs数量增加，可通过增加海马神经元、少突胶质前体细胞和神经干细胞的数量，减轻氧化应激和促进髓鞘形成，发挥神经保护作用（Pusic et al.，2014，2016）。Wang等（2020）实验证实，运动会增加小鼠大脑中携带miR-126的EPC-EXs数量，激活脑内BDNF-酪氨酸激酶受体（tyrosine kinase receptor B，TrkB）-Akt信号通路，抑制神经元凋亡，安静组则没有此效应。研究表明，运动可以促进EXs作用于脑部等远端组织，发挥提高神经元功能和改善AD脑内神经病变的作用。

综上，EXs通过影响外周循环和中枢神经系统，提高运动的整合效应，如携带miR-126的EPC-EXs。运动期间的EXs在促进机体整体健康水平和干预AD方面起到重要的调节作用。因此，EXs介导运动提高机体整合效应是干预AD的机制之一，深入研究更能全面理解运动促进脑健康和防治AD的生物学机制。

4 结论与展望

本文从EXs与AD关系出发，结合运动的影响，系统分析EXs介导运动干预AD的作用机制（图1）。其主要包括：1）运动促使机体EXs分泌和释放，增强机体清除代谢废物的能力，防止废物进入脑组织，减少AD脑内Aβ的堆积。2）运动可调节EXs携带的运动因子，并将其转移到CNS，改善AD的病理。3）运动通过EXs在外周循环和中枢神经系统发挥作用，产生机体整合效应，阻止AD发展。目前，国内外对EXs介导运动促进大脑健康的相关研究还处于探索阶段，未来研究中，1）需进一步阐明EXs是否为运动改善AD关系的必要条件。即在敲低EXs的情况下，运动对于改善AD症状的作用是否消失或者减弱。2）思考不同运动方式及强度对EXs数量、来源、成分、作用靶点及调控信号的作用机制。3）人体是一个联系的整体，已知运动可通过多条路径干预AD，那么EXs是不是连接这些路径的桥梁？因此，深入探究EXs介导运动干预AD的生物学机制，有望寻找改善和治疗AD的新靶点药物。此外，运动期间的EXs对代谢性、神经退行性等疾病是否具有类似的潜在益处，也值得运动医学领域学者关注和研究。

图1 EXs介导运动干预AD的机制Figure 1.Mechanisms of EXs-mediated Exercise Intervention inAD