白细胞介素-7 促进原发性肾病综合征患儿外周血CD14+单核细胞活性

2020-12-03冯仕品

临床儿科杂志 2020年11期

刘君冯仕品

电子科技大学医学院附属妇女儿童医院成都市妇女儿童中心医院儿童肾脏内科（四川成都 610017）

儿童原发性肾病综合征（idiopaticnephrotic syndrome，INS）是多种病因造成的肾小球基底膜通透性增高，导致蛋白从尿中排出，表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿、高脂血症及其他代谢紊乱[1]。INS的病因尚未完全阐明，目前认为免疫系统功能失调、系统性循环因子异常分泌、肾脏足细胞遗传性结构异常等因素均参与了INS发病[1-2]。在非遗传因素中，多种免疫细胞和细胞因子功能失调所造成的免疫紊乱是INS的重要诱因之一[3]。白细胞介素-7（interleukin-7，IL-7）主要通过IL-7受体α链（即CD127）发挥作用，IL-7/CD 127 信号通路调控并维持免疫细胞分化、发育和增殖，在感染、肿瘤、自身免疫性疾病中发挥重要作用[4]。IL-7还可增强肺癌患者CD14+单核细胞的抗原提呈功能，诱导CD4+T细胞活化[5]。既往研究发现，激素敏感型INS患儿血清IL-7水平升高，且与机体凝血功能密切相关[6-7]。但有关IL-7对INS患者免疫细胞的调节作用尚未见相关报道。因此，本研究利用体外细胞培养系统，观察IL-7对INS患儿CD14+单核细胞活性的影响，初步探讨IL-7在INS发病中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2019年1月—2019年7月在成都市妇女儿童中心医院儿童肾脏内科住院的INS患儿。研究对象入选标准：①年龄＜16岁；②诊断符合中华医学会儿科学分会肾脏病学组2016年指南[8]，即24 h尿蛋白定量＞50mg/(kg·d)，血清胆固醇＞5.7 mmol/L，血清白蛋白＜30 g/L；③未经糖皮质激素治疗；④排除慢性病毒感染、自身免疫性疾病、糖尿病、恶性肿瘤、重要脏器功能衰竭等疾病。选择同时期在本院体检中心接受健康查体的儿童作为对照组，入选标准：①年龄＜16岁；②体检健康，无遗传代谢性疾病；③近半年内无其他疾病史。

本研究方案通过成都市妇女儿童中心医院伦理委员会批准，入组患儿法定监护人签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞分离清晨空腹采集外周静脉血20 mL，EDTA 抗凝。使用人外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝公司）、采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），调整细胞浓度至2×107个/mL，加入含10%DMSO的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），液氮冻存备用。

1.2.2 CD 14+单核细胞和CD 4+T 细胞分选和培养采用磁珠分选法、使用人CD 14 MicroBeads（德国美天旎公司）和人CD4+细胞分选试剂盒（德国美天旎公司）对PBMC中CD14+单核细胞和CD4+T细胞进行分选，操作按说明书要求进行。分选的细胞使用含10% FBS的RPMI 1640于37 ℃、5%CO2条件下进行培养。从33 例INS 组中选取10 例INS 患儿分选的105个CD14+单核细胞，接种于96孔板，设立4个复孔，其中2 个复孔加入培养液，另外2 个复孔加入重组人IL-7（25 μg/L，美国Peprotech公司）刺激培养，12h后收集培养上清。

1.2.3 CD 14+单核与CD 4+T 细胞共培养系统建立选择17 例INS 患儿和7 例对照组纯化的CD 14+单核细胞，加入的重组人IL-7（25 μg/L）刺激培养12h，洗涤后建立间接接触和直接接触共培养系统[9]。间接接触培养系统：两种细胞以1:1的比例分别接种于Transwell培养平板上层小室与下层培养孔中，向下层培养孔中加入抗CD3抗体（1 μg/L）。直接接触培养系统：两种细胞以1:1的比例直接混合，加入抗CD3抗体（1 μg/L）。将CD4+T细胞单独培养作为对照，培养48 h后收集细胞。另取8例INS患儿CD14+单核细胞与自体CD 4+T细胞建立直接接触共培养系统，向培养液中加入抗人IL-6 中和抗体（20 ng/mL，美国Invi vogen公司），培养最后12 h加入布雷非德菌素A（10μg/mL）。

1.2.4 CD 127 表达以及CD 4+T 细胞分泌干扰素-γ（IFN-γ）和IL-17的检测采用流式细胞术检测。PBMC 使用抗人CD-14-FITC 和抗人CD 127-PE 染色，4 ℃避光孵育30 min。CD14+单核细胞与CD4+T细胞共培养的细胞加入抗人CD 4-PerCP 4 ℃避光孵育30 min，破膜后加入抗人IFN-γ-APC和抗人IL-17-PE，4 ℃避光孵育20 min。流式抗体购自美国BD公司。使用FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）获取细胞，FlowJo10.6软件分析结果。

1.2.5 CD 14+单核细胞CD 127 mRNA 检测采用实时定量PCR 进行检测。105个CD 14+单核细胞使用RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）抽提总RNA，取1 μg 总RNA，使用PrimeScript 反转录试剂盒（北京宝日生物技术有限公司）进行反转录，-20 ℃保存cDNA。使用TB Green实时定量PCR试剂盒（北京宝日生物技术有限公司）进行PCR 反应。引物序列为，①CD 127 上游：5’-AAA GTT TTA ATG CAC GAT GTA GCT T-3’；CD127下游：5’-TGT GCT GGA TAA ATT CAC ATG C-3’。②GADPH上游：5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’；GAPDH下游：5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’。每个样本做3个重复，在ABI 7500实时定量PCR仪（美国Applied Biosystem公司）上进行检测。

1.2.6 培养上清中细胞因子表达检测采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测。使用ELISA 检测试剂盒检测血清IL-7 水平、培养上清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、人单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和人肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。所有ELISA试剂盒均购自美国eBioscience公司，操作按说明书要求进行。

1.3 统计学分析

使用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用裂区设计资料的方差分析或单因素方差分析，存在差异后进一步两组间比较采用SNK-q检验，两组间比较采用两独立样本t检验或配对t检验；非正态分布计量资料以中位数（四分位数范围）表示，组间比较采用Wilcoxon 秩和检验。计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

共纳入INS组患儿33例，男23例、女10例，年龄3.0～13.0 岁，平均年龄（6.9±2.9）岁，发病时间7.0～30.0 d，平均病程（20.0±8.0）d，24 h 尿蛋白（4.1±1.8）g，血清白蛋白（20.0±6.0）g/L，胆固醇（6.8±1.4）mmol/L。其中24 例表现为单纯型，9 例表现为肾炎型。对照组15 例，男11 例、女4 例，年龄4～14岁，平均年龄（7.9±2.5）岁。两组性别构成、年龄、身高、体质量、体质指数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 血清IL-7及CD14+单核细胞中CD127表达

INS 患儿血清IL-7 水平高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。CD 14+单核细胞中CD 127 平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）的典型流式图检测见图1。

CD14+单核细胞中CD127 MFI和mRNA的相对表达量在对照组和INS患儿之间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 对照组和INS患儿一般情况、血清IL-7及CD14+单核细胞中CD127表达比较

图1 CD14+单核细胞中CD127 平均荧光强度典型流式细胞检测图

2.3 IL-7对CD14+单核细胞分泌炎症细胞因子影响

经IL-7 刺激的CD 14+单核细胞分泌IL-1 β、IL-6、IL-8、MCP-1和TNF-α的水平高于无IL-7刺激的CD 14+单核细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.4 IL-7刺激对CD14+单核细胞诱导的CD4+ T细胞活化的影响

使用IL-7 刺激CD 14+单核细胞后，分别建立CD 14+单核细胞与自体CD 4+T 细胞间接接触和直接接触共培养系统，CD 4+T 细胞单独培养为对照组。培养48 h后检测CD4+T细胞分泌IFN-γ（Th1细胞）和分泌IL-17（Th17细胞）的比例，典型流式散点图见图2。

采用裂区设计的方差分析对INS 分选细胞和对照组分选细胞中Th1和Th17细胞比例的差异进行分析。培养方法作为一级处理因素，是否加入IL-7作为二级处理因素。INS分选细胞中，培养方法和是否加入IL-7两因素的交互作用有统计学意义（FA×B=15.79、11.09，P＜0.001），直接接触培养中Th 1 和Th 17 细胞比例均高于间接接触培养系统（FA=50.67、34.94，P＜0.001），IL-7 对Th 1 和Th 17 细胞比例有影响（FB=23.68、17.27，P＜0.001）。进一步分析发现，在间接接触培养系统中，无IL-7刺激和经IL-7刺激Th1和Th17细胞比例与CD4+T细胞单独培养的差异均无统计学意义（P＞0.05），在直接接触培养系统中，Th1和Th 17 细胞比例均显著高于CD 4+T 细胞单独培养（t=5.226、3.934，P＜0.01）；经IL-7 刺激后，Th 1 和Th17细胞比例显著高于无IL-7刺激（t=3.544、3.548，P＜0.01）。见表3。对照组分选的细胞中，培养方法和是否加入IL-7 两因素的交互作用有统计学意义（FA×B=4.281、3.358，P＜0.05），直接接触培养中Th1和Th17细胞比例均高于显著高于间接接触培养系统（FA=14.82、7.934，P＜0.01），IL-7对Th1和Th17细胞比例有影响（FB=3.814、5.638，P＜0.05）。在直接接触培养系统中，经IL-7刺激后，Th1和Th17细胞比例显著高于无IL-7刺激（t=3.999、4.150，P＜0.01）。见表3。

2.5 抗IL-6抗体对IL-7介导INS患儿CD14+单核细胞诱导CD4+ T细胞活化的影响

表2 IL-7刺激对INS患儿CD14+单核细胞分泌细胞因子影响(，pg·mL-1)

图2 典型流式细胞检测图

INS患儿CD14+单核细胞在IL-7刺激后，与自体CD 4+T 细胞直接接触共培养，并向培养液中加入抗人IL-6中和抗体。

无刺激组、经抗IL-6 刺激组、经IL-7 刺激组、经IL-7+抗IL-6刺激组4组之间Th1比例差异有统计学意义（F=3.67，P＜0.05）。两两比较发现，经IL-7 刺激组Th1比例均高于无刺激组和经IL-7+抗IL-6刺激组（P＜0.05）。见表4。

3 讨论

IL-7 在感染、肿瘤和自身免疫性疾病中均发挥重要的免疫调控作用，通过CD 127 介导的信号通路增强CD 8+T 细胞杀伤功能，促进病原体和肿瘤细胞的清除[10-11]。人类免疫缺陷病毒慢性感染患者接受IL-7治疗可降低血浆可溶性CD14表达，提示IL-7可降低机体系统性炎症[12]。相反，IL-7外显子5缺陷基因编码的蛋白刺激可诱导CD 14+单核细胞促炎因子表型，增加脂类代谢相关基因表达[13]。本研究发现，INS患儿外周血IL-7表达升高，这与既往的研究结果一致[6-7]。但IL-7对INS患儿CD14+单核细胞调控作用的研究较少。本研究发现，CD14+单核细胞表面的模型CD127蛋白和总CD127（模型和可溶型）mRNA相对表达量在对照组和INS患儿之间的差异无统计学意义，与在肝癌患者中的研究结果一致[14]，提示炎症和肿瘤均未改变单核细胞中CD127的表达，INS患儿CD14+单核细胞对IL-7的反应性升高与CD127水平无关。而IL-7刺激可促进INS患儿CD14+单核细胞分泌炎症细胞因子，提示INS患儿中升高表达的IL-7可增强CD14+单核细胞促炎功能，诱导INS病程中的炎症应答，促进疾病进展。

在类风湿性关节炎患者中，CD 14+单核细胞可诱导CD 4+T 细胞活化的过程依赖两种细胞的直接接触[5]。本研究发现，CD14+单核细胞在间接接触共培养系统中不能诱导Th 1 和Th 17 的表型活化，仅在CD 14+单核细胞和CD 4+T 细胞直接接触的条件下，CD 14+单核细胞才能有效介导INS 患儿CD 4+T 细胞向Th 1 和Th 17 细胞的活化，这与既往的研究结果一致[5,9,15]。提示CD14+单核细胞主要通过其抗原提呈功能诱导CD 4+T 细胞活化，但细胞因子分泌在这一过程中是否发挥作用尚不清楚。由于IL-7主要通过促进IL-6分泌诱导病毒特异性CD8+T细胞和滤泡辅助性T 细胞的活性[10,16]，而本研究发现，在INS 患儿中，IL-7均可增强CD14+单核细胞诱导的CD4+T细胞活化，说明IL-7可促进CD14+单核细胞功能。而抗IL-6中和抗体可抑制IL-7诱导的CD14+单核细胞对CD4+T细胞的调控作用，提示在INS患儿中，CD14+单核细胞对CD4+T细胞的调控作用亦有赖于IL-6的分泌。然而本研究具有一定局限性，未设立治疗前后INS 患儿的对比，因此，IL-7 对INS 患儿CD 14+单核细胞的调控机制仍有待深入探讨。

综上，INS 患儿升高表达的IL-7 可促进CD 14+单核细胞分泌炎症细胞因子，IL-7 刺激的CD 14+单核细胞可能通过直接接触和分泌IL-6 诱导INS 患儿CD4+T细胞活化，提示IL-7可增强CD14+单核细胞的功能，在INS 中发挥促进炎症影响、诱导疾病进展的作用。

表3 IL-7刺激对INS患儿CD14+单核细胞诱导Th1和Th17细胞活化影响(，%)