丝素蛋白/泊洛沙姆载叶酸水凝胶的制备工艺研究

蓝金霞，高彭飞，李家敏，张兵锋

(宜春学院 化学与生物工程学院，江西 宜春 336000)

蚕丝中丝素蛋白(Silk Fibroin，SF)是一种半结晶聚合物，主要组成成分是β-折叠晶体和非晶体(微孔隙和无定形结构)，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18种氨基酸构成，具有良好的生物相容性、生物可降解性、pH敏感性、组织粘附性等活性[1，2]。泊洛沙姆P188是聚氧乙烯-聚氧丙稀的共聚物，常用于增加药物的溶出，其凝胶化作用是因为泊洛沙姆P188形成了分子间氢键[3]。

水凝胶(Hydrogel)是一种具有网状交联结构的高分子材料，是以水为分散介质的凝胶。丝素水凝胶是属于蛋白材料中的一种形态，由于其含有三维网状结构故具有优异的可透性和可塑性，可以作为药物的载体，骨填充材料和细胞培养支架。丝素蛋白-泊洛沙姆P188水凝胶应用于药物缓释系统，可以延缓药物在人体的释放、吸收、代谢及排泄，充分发挥出药物的生物活性，保持药效的持续性和减少药物的毒副作用[4，5]。药物的控释效果可通过对丝素蛋白的β-折叠的含量改变来实现[6]。因此在生物医学中备受关注，尤其在细胞增殖、药物缓释等方面应用较多[7，8]。本文主要研究丝素蛋白-泊洛沙姆水凝胶的制备工艺，考察水凝胶的释药现象。

1 材料与仪器

1.1 材料

蚕丝(湖州恩贝希生物原材有限公司)；牛血清蛋白(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；考马斯亮蓝(天津中津化工有限公司)；叶酸(上海蓝季科技发展有限公司，批号：091015)；无水碳酸钠(广东海光华化学试剂厂，批号：20150227，AR)；氯化钙(中国四联化工厂，批号：040601，AR)；乙二胺四乙酸(天津市永大化学试剂有限公司，批号：20121121，AR)；浓磷酸(天津市永大化学试剂开发中心，批号：200695，AR)；磷酸二氢钾(成都科龙化工试剂厂，AR)；氢氧化钠(天津市永大化学试剂有限公司，批号：20150316，AR)；甲醇(天津市福晨化学试剂厂，批号：1703091，GR)；乙醇(天津市天福达实业公司，批号：20171026，AR)。

1.2 仪器

DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；SQP电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；752N紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)；WH—3微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；HH-W420数显三用恒温水箱(金坛市科析仪器有限公司)；恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)。

2 方法与结果

2.1 丝素蛋白的制备

脱胶：将蚕丝剪成小片，投入浴比1:50(20 g蚕丝，5 g碳酸钠，1000 mL去离子水)0.5 %碳酸钠溶液中煮沸，30 min后去离子水冲洗3次。重复上述步骤2次，最后将3次脱胶后的蚕丝用去离子水洗净，放入80 ℃烘箱内，干燥，得到丝素[9]。

溶解：配制摩尔质量比为CaCl2:C2H5OH:H2O =1:2:8的混合液，将丝素以1:20的浴比，放入80 ℃水浴恒温锅内，搅拌2 h，溶解后得到丝素蛋白和氯化钙的混合溶液[10]。经冷却后，将丝素蛋白溶液转移至透析袋(8000～12000 Da)中，用蒸馏水透析3 d，每间隔4 h替换一次蒸馏水，透析完成后，抽滤，然后放入4 ℃冰箱待用。

2.2 丝素蛋白的含量测定

2.2.1 标准曲线的绘制

试剂：0.1 mg/mL的标准牛血清蛋白溶液；丝素蛋白溶液；考马斯亮蓝染料溶液。

表1 标准曲线的绘制

按表1分别向6支试管内加入各试剂，利用微型漩涡混合仪充分混匀，5 min后采用紫外分光光度法在595 nm波长处以0号管调零，测定各试管的吸光度值(A)。以吸光度值(A)对浓度(C)作图绘制的标准工作曲线：A = 4.7221x+ 0.036。如图1所示。

图1 丝素蛋白的标准曲线

2.2.2 重复性实验

用移液枪精密量取丝素样品1 mL分别置于已编好号的5支试管中，再向其中4份各加入5 mL的考马斯亮蓝溶液，再用1 mL的去离子水加5 mL的考马斯亮蓝溶液调零，测量其在可见光为595 nm的波长处的吸光度分别为：0.381、0.359、0.376、0.376、0.361。计算其相对标准差RSD=0.5 %，结果说明此方法重现性良好。

2.2.3 稳定性实验

2.价值标准多元趋向明显。学生的思想道德标准逐渐增多，追求不同的价值观，是非观念日渐淡薄，出现一些与主流价值标准不同的判断标准，对构建社会主义核心价值体系工作有一定程度的冲击。

用移液枪精密吸取“重现性试验”项下的第3份丝素溶液1 mL，向其中加5 mL考马斯亮蓝溶液，再用1 mL的去离子水加5 mL的考马斯亮蓝溶液调零，于0 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min时分别测定吸光度。测定结果分别为：0.568、0.557、0.554、0.548、0.541。计算其相对标准偏差RSD=1.83 %，结果表明同一样品在5 min内的测定结果基本稳定。

2.2.4 精密度实验

使用移液枪取牛血清蛋白对照品溶液1 mL，置于试管中，并向试管中加入5 mL的考马斯亮蓝溶液，再用1 mL的去离子水加5 mL的考马斯亮蓝溶液调零，在可见光为595 nm的波长处分别测其吸光度5次。测定结果为：0.284、0.283、0.293、0.282、0.291，测出的平均值为0.2866，相对标准差RSD=1.75 %，表明该仪器精密度良好。

2.2.5 加样回收率实验

使用移液枪精密量取己知含量的丝素蛋白溶液0.5 mL，共5份，分别精密加入对照品牛血清蛋白液0.5 mL，置于已编好号的试管中，再向各个试管中分别加入5 mL考马斯亮蓝溶液，再用5mL的考马斯亮蓝溶液加1 mL的去离子水调零，在可见光的波长为595 nm处测定其吸光度分别为：0.514、0.523、0.518、0.517、0.517，回收率分别为：100.2%、103.7%、101.8%、101.4%、103.4%。计算样品平均回收率为102.1%，相对标准偏差RSD = 1.42%。由此数据说明建立的测定方法的准确度良好。回收率(%)=(实测丝素蛋白含量-样品中丝素蛋白含量)/对照品加入量×100%。

2.2.6 丝素蛋白浓度的测定

取1 mL已经过稀释10倍的丝素溶液，加入考马斯亮蓝溶液5 mL混匀，5 min后测定其在可见光为595nm处的吸光度值，参照标准曲线及线性回归方程即可求得蛋白质浓度。测定吸光度分别为：0.545、0.544、0.546，代入线性回归方程y=4.7221 x + 0.036，得出丝素蛋白浓度分别为：0.1078 mg/mL、0.1076 mg/mL、0.1080 mg/mL。求得已稀释的丝素蛋白的浓度平均值为0.1078 mg/mL。

2.3 丝素蛋白-泊洛沙姆载叶酸水凝胶的制备

2.3.1 丝素蛋白与泊洛沙姆的比例对水凝胶的影响

取3 mL丝素蛋白溶液分别加入5支试管中，依次将泊洛沙姆P188与丝素溶液以1:1、4:1、10:1、16:1、20:1的比例制备水凝胶，经过比较均匀性和涂展性可得16:1的比例水凝胶的状态为整体均匀一致，无颗粒，无团块，无气泡，有弹性，容易涂抹且涂抹处皮肤舒适[11]。

2.3.2 温度对水凝胶的影响

将泊洛沙姆与丝素溶液16:1的混合液置于37 ℃水浴中，观察其凝胶状态，数小时后仍为流动的液体，将温度逐渐上升，分别观察在50 ℃、60 ℃、70 ℃水浴中是否形成凝胶，经过比较均匀性和涂展性可得70 ℃时且质量比为16:1的泊洛沙姆P188与丝素溶液形成水凝胶状态为整体均匀一致，无颗粒，无团块，无气泡，有弹性，容易涂抹且涂抹处皮肤舒适。

2.3.3 时间对水凝胶的影响

将泊洛沙姆与丝素溶液以质量比为16:1的混合溶液放入70 ℃的水浴中，分别在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h时观察形成凝胶的状态，发现6 h时形成水凝胶状态为整体均匀一致，无颗粒，无团块，无气泡，有弹性，容易涂抹且涂抹处皮肤舒适。

2.4 丝素蛋白-泊洛沙姆载药水凝胶的体外释放

2.4.1 叶酸标准曲线

精密称取叶酸0.1003 g于10 mL量瓶中，加入10 mL甲醇，超声处理使其充分溶解，并用甲醇定容，即得到10 mg/mL的溶液；再吸取1 mL已配好的上述溶液于容量瓶中，加入磷酸盐缓冲液，定容至刻度线，即得到1 mg/mL标准溶液；最后用上述同样的方法，再精密量取适量标准溶液，加入磷酸盐缓冲液定容，使其浓度分别为10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL。用紫外分光光度计测定叶酸在λ=365 nm波长处的各浓度的吸光度，建立叶酸的标准曲线，用吸光度对浓度作标准曲线，得到回归方程：y=0.0116x- 0.0004，R2=0.9977。

2.4.2 体外释放

在透析袋中装入载有叶酸的丝素蛋白-泊洛沙姆水凝胶，浸入装有pH = 7.4的磷酸盐缓冲液的锥形瓶(100 mL)中，37 ℃下在恒温培养振荡器中振荡(频率设为60 r/min)，每隔0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、2h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h从锥形瓶中取出4 mL的释放液，并向锥形瓶里加入4 mL的PBS缓冲液，同时用紫外分光光度计分别测量叶酸药物在波长为365 nm处的释放液的吸光度。根据线性回归方程，计算释放液的释放量及药物浓度，随着时间的增长，计算出累积释药百分率，并绘制释药曲线[12]。同法测定游离叶酸的累计释放量。如图2所示，游离叶酸在前4 h具有突释现象，累积释放量达到了95 %，与之相比，叶酸水凝胶前4 h累积释放量为24 %，在36 h释放量达到50 %，具有良好的缓释效果。

图2 丝素蛋白-泊洛沙姆载药水凝胶的释药曲线

3 讨论与结论

在研究丝素蛋白-泊洛沙姆载叶酸水凝胶的制备工艺过程中，丝素蛋白和考马斯亮蓝溶液应在一周内配制使用。丝素蛋白在取用后立即放回4 ℃冰箱内。在丝素蛋白进行含量测定时，使用紫外分光光度计时，确保在其预热稳定，校准调零，调节波长为595 nm后再进行实验操作，得到丝素蛋白的标准曲线y=4.7221 x + 0.036，R2=0.9964，线性关系良好，计算得到蛋白浓度为2.5 mg/mL。

制备丝素蛋白-泊洛沙姆水凝胶的影响因素有丝素蛋白与泊洛沙姆的比例，温度和时间[13]。通过不同比例，不同温度，不同时间所形成的凝胶之间比较，最终确定泊洛沙姆与丝素蛋白以16:1的比例，在70 ℃水浴6 h形成的凝胶具有最优的均匀性和涂展性。丝素蛋白水凝胶制备工艺良好，具有储存和可持续释放药物的能力，叶酸的体外缓释速率先快后慢，在36 h内达到50 %，说明丝素蛋白-泊洛沙姆水凝胶可应用于药物的缓释系统。根据此制备工艺得到的载药水凝胶具有较优的均匀性和涂展性，且具有一定的缓释作用。