黄连素体外抗川崎病儿童血小板聚集作用的探讨

刘云锋， 郑 浩， 车 迪， 皮 蕾， 付兰燕， 顾晓琼

（1.广州市妇女儿童医疗中心检验科，广东 广州 510623；2.广州市妇女儿童医疗中心标本库，广东 广州 510623）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种以全身中、小动脉炎症性病变为主要特征的急性发热性疾病，可累及冠状动脉引起冠状动脉扩张和动脉瘤，流行病学研究结果显示，近年来亚洲地区KD的发病率呈上升趋势[1-2]。KD主要的病理特征为血液高黏、高聚、高凝，血小板（platelet，PLT）大量聚集并引起血栓栓塞[3]，是我国小儿后天性心脏病的主要原因之一。目前临床上常以阿司匹林作为该病抗PLT聚集的药物，但有研究结果显示，部分患者会出现药物抵抗、并发冠状动脉损伤及黏膜损伤或消化道出血等不良症状[4]。近年来，黄连素（berberine，BB）作为中国传统中药，其抗PLT聚集的功能引起了人们的重视。BB能降低二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、胶原和花生四烯酸诱导的PLT血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的释放，能明显地抑制PLT激活因子（platelet activating factor，PAF）途径[5]，从而抑制PLT聚集。除此之外，有临床研究结果表明，BB能改善同样具有血液高黏、高聚等血液流变学改变的2型糖尿病，降低其血浆黏度、减少红细胞和PLT聚集[6]。然而，BB是否能改善KD患者PLT聚集情况，尚未见文献报道。本研究通过体外实验，观察BB能否降低KD患儿PLT聚集率，为BB用于KD的抗栓治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年8月—2019年8月在广州市妇女儿童医疗中心心血管科确诊的71例KD患儿作为KD组，其中男45例、女26例，年龄（2.81±1.22）岁；另选取同期在儿童保健科就诊的71名健康儿童作为对照组，其中男49例、女22例，年龄（2.48±1.31）岁。2组研究对象年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。KD患儿均采用2004年美国心脏协会制定的诊断指南[7]确诊，所有患儿均排除腺病毒感染、EB病毒感染、药物过敏综合征、Stevens-Johnson综合症、猩红热等发热性疾病。对照组儿童均排除既往KD病史、感染性疾病、心血管疾病、阿司匹林过敏症、PLT减少症等。

1.2 方法

采集所有研究对象全血并用乙二胺四乙酸抗凝，110×g离心5 min，分离上层富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）。取500 μL PRP并加入等量0.9%氯化钠溶液后混匀，110×g离心5 min，洗涤1次后弃去上清，加入500 μL 0.9%氯化钠溶液重悬并调节PLT浓度为（100～300）×109/L。加入0.025 mol/L氯化钙15 μL混匀，静置30 min待测。运行PLT聚集仪（美国Helena Laboratories公司），取静置后的待测标本分成2份，每份各200 μL。使用0.9%氯化钠溶液对仪器进行空白校准。校准完成后其中1份加入二甲基亚砜25 μL，另一份加入5 mg/mL BB 25 μL，37 ℃温浴3 min后，迅速加入5 μmol/L ADP（美国Helena Laboratories公司）25 μL开始测定，使用PLT聚集仪绘制PLT聚集曲线并获得最大聚集率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。呈偏态分布的计量资料以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用秩和检验。样本间计数资料比较采用配对t检验分析。年龄、性别等计量资料的相关性采用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验条件选择

对不同离心速度（90、110、130×g）和不同离心时间（5、8、10、15 min）进行比较，结果显示，110×g离心5 min所得PRP的PLT浓度最高。见表1。

2.2 BB浓度选择

选择10例健康体检者标本，分别加入二甲基亚砜及不同浓度BB（0、2.5、5.0、10.0 mg/mL）各25 μL后测定PLT最大聚集率。结果显示，当BB浓度为0、2.5、5.0、10.0 mg/mL时，PLT最大聚集率分别为32.1（27.0～37.8）%、21.6（15.3～23.4）%、11.2（9.0～18.3）%、 10.7（8.1.0～17.4）%，因此选取5 mg/mL为BB最适实验浓度。

2.3 BB对PLT聚集率的影响

KD组和对照组的PLT最大聚集率均下降，2组样本添加BB前、后PLT聚集率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 添加BB前、后PLT聚集率比较 %，±s

表2 添加BB前、后PLT聚集率比较 %，±s

注：与添加BB前PLT聚集率比较，*P＜0.05

组别 例数 加BB前 加BB后 t值 P值对照组 71 26.25±3.32 10.32±2.11* 9.523 ＜0.05 KD组 71 18.32±2.51 6.23±1.59*10.987 ＜0.05

3 讨论

KD是一种以全身小动脉炎为病理改变的疾病，多发于婴幼儿及儿童，绝大多数患者经过丙种球蛋白治疗后可逐渐转归，预后良好。但15%～30%的患者可侵犯冠状动脉，严重者可并发冠状动脉瘤破裂、心肌梗死等，是儿童后天性心脏病的主要原因[7]。KD患者由于免疫功能异常，在炎性因子作用下，血管内皮细胞受到刺激，内皮下的胶原组织暴露，诱导血液中的PLT及淋巴细胞、单核细胞黏附于暴露的胶原纤维上；同时PLT发生形态变化，贮存于致密颗粒内的ADP及5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）被释放，进一步促使PLT聚集。由于血液长期处于高凝高聚状态，容易形成血栓引起冠状动脉严重狭窄和闭塞，甚至会形成冠状动脉瘤，危害儿童健康。

阿司匹林是目前最主要的治疗K D的抗栓药物，主要通过抑制P LT环氧化酶（cyclooxygenase，COX）乙酰化，阻止花生四烯酸（arachidonic acid，AA）转变为前列腺素环内过氧化物，阻断TXA2生成[8]，从而达到抗PLT聚集的目的。但阿司匹林治疗存在个体差异，少数个体使用阿司匹林后低反应或无反应，也有报道称长期大剂量服用阿司匹林，以及在服用阿司匹林药物时感染水痘或流感病毒的患儿发生瑞氏综合征的风险较其他儿童高[9]。由于阿司匹林抗栓治疗存在局限性，所以临床上需要有其他药物协助阿司匹林一同改善KD患儿PLT聚集情况。

BB是从毛茛科黄连植物根状茎中提取的一种植物生物碱，以前主要用于治疗肠道炎症伴发热。近年来有研究发现，BB具有明显的抗肿瘤及抗2型糖尿病的作用[6]。另有研究结果显示，BB是一种具有抑制凝血酶诱导PLT活性的直接凝血酶抑制剂[10]。BB主要通过降低TXA2、提高环磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）含量来调节PLT聚集的第二信使Ca2+，使Ca2+从致密小管载出减少，抑制PLT释放功能。cAMP含量增高能够抑制磷酯酶A的活化，从而通过抑制PAF途径[5]，达到抗PLT聚集的目的。有研究结果表明，BB联合其他常规药物能更有效地抑制PLT聚集[11]。

本研究通过体外实验，比较加入BB前、后KD组和对照组PRP PLT聚集率的变化，初步探讨BB是否具有抗KD患儿PLT聚集的作用。实验结果表明，使用110×g离心5 min制备PRP，体外加入5 mg/mL BB溶液进行预处理为最适反应条件。本研究结果显示，对照组和KD组PRP体外经BB溶液处理后，PLT聚集率均比处理前有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。而且经BB处理后KD组PLT聚集率与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），表明BB在体外能有效发挥抗PLT聚集作用。本研究中KD组基础PLT聚集率为（18.32±2.51）%，比正常组PLT聚集率[（26.25±3.32）%]低，这可能是由于本实验使用的KD患儿标本均是在患儿确诊并使用阿司匹林抗栓治疗后收集的，导致KD组基础PLT聚集率比对照组低。然而即便如此，加入BB后，对照组与KD组PLT聚集率仍明显降低，由此推测，BB和阿司匹林可能在抗栓治疗上有协同作用。

由于本研究样本量小，未能进行深入研究，也未进行相关动物实验验证，希望今后进一步验证BB在KD患儿抗栓治疗中的作用，降低KD患儿血栓形成风险提供参考。