TCF7L2与WNT7b相互作用促进胃癌细胞增殖与转移

杨留洋，高 倩，程 民，徐婷娟，胡世莲，沈国栋

胃癌是常见恶性肿瘤之一，我国胃癌每年新发病例与死亡病例均接近全球的一半[1]。由于缺乏特异的生物标志物及靶向治疗药物，这给胃癌诊治带来许多困难，大多数患者治疗后生存期仍然较短[2]。WNT/β-catenin通路是WNT信号中的经典通路，在胚胎发育及成体干细胞更新中发挥关键作用，其信号异常激活被认为与肿瘤发生有关[3]。课题组前期研究发现WNT/β-catenin通路中转录因子7类似物2(transcription factor 7-like 2，TCF7L2)能促进胃癌细胞增殖及对化疗耐药[4]，但其具体机制尚不清楚。该研究揭示了TCF7L2与配体WNT7b通过相互增强表达的正反馈方式促进胃癌细胞增殖与转移的作用机制，为寻找用于胃癌诊疗的标志物分子及研发新药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1病例资料 按照安徽医科大学附属省立医院医学伦理委员会批准方案(编号：2019-X(H)-001)，收集2019年5～12月在安徽医科大学附属省立医院行胃癌手术且病理诊断为胃腺癌的标本17例(患者均签署了知情同意书)。

1.1.2细胞株与试剂 人胃癌细胞株NCI-N87(以下简称N87)与SGC7901购自中国医学科学院肿瘤研究所。胎牛血清(FBS)购自美国Clark公司；RPMI1640培养基购自美国Corning公司；RIPA裂解液及5×蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白磷酸酶及蛋白酶抑制剂(cocktail)购自瑞士Roche公司；BCA试剂盒与化学发光显影液购自美国Thermo-fisher公司；β-actin兔抗人抗体、TCF7L2兔抗人抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购自美国Cell Signaling Technology公司；人重组WNT7b蛋白购自台湾Abnova公司；放线菌素D购自美国MCE公司；RNA抽提试剂盒购自德国Analytik Jena公司；逆转录反应试剂盒及荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自北京全式金生物技术公司；PCR芯片购自美国Qiagen公司；LipoHigh脂质体高效转染试剂、G418(遗传霉素) 与TRIzol购于生工生物工程(上海)股份公司；TCF7L2过表达质粒与shTCF7L2质粒由上海吉玛制药技术有限公司构建；TOP-flash和pRL-TK质粒购自上海权阳生物科技公司；双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 N87、SGC7901等人胃癌细胞株培养于含10% FBS的RPMI1640培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中饱和湿度条件下培养。

1.2.2质粒转染 提前24 h在6孔培养板中移植N87或SGC7901细胞(约4×10个5/孔)，待细胞生长约60%满度时即可用于转染。将LipoHigh转染试剂按照说明书配制为0.25 ml转染液，另配0.25 ml含0.5 μg pcDNA3.1-TCF7L2或者shTCF7L2质粒的无血清培养基，室温孵育5 min，将上述2种溶液混合后室温孵育20 min，逐滴加入6孔培养板，于培养箱中孵育6 h，更换含有血清的完全培养基，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养48 h，分别得到瞬时转染的SGC7901/TCF7L2与N87/shTCF7L2细胞；稳转细胞株则后续培养在含0.5 mg/ml G418的完全培养基中进行筛选、 挑取单克隆后获得。

1.2.3mRNA稳定性检测 参考Li et al[5]的方法，在6孔板中培养N87细胞(4×105个/孔)，待细胞贴壁，分为对照组和WNT7b组(培养基中含量为200 ng/ml)分别处理48 h后，加入放线菌素D(培养基中含量为2 μg/ml)分别处理2、4、6 h，收取细胞后使用qPCR方法检测。

1.2.4qPCR检测 分别使用TRIzol法抽提组织样本RNA，RNA抽提试剂盒提取并纯化胃癌细胞株的RNA，测定样品RNA浓度和纯度后，根据逆转录试剂盒说明书操作逆转录为cDNA，然后使用qPCR试剂盒进行检测，参数如下：94 ℃、30 s预变性；94 ℃、5 s，60 ℃、30 s(荧光采集)，共40个循环，读取每个反应的Ct值，2-ΔΔCt表示基因相对表达量。GAPDH作为内参，引物名称与序列见表1。

表1 qPCR引物名称与序列

1.2.5Western blot检测 提取各组N87细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液后于水浴锅中煮沸8 min，经SDS-PAGE电泳分离后湿转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温条件下封闭1 h。一抗以兔抗人β-actin为内参，兔抗人TCF7L2为目的蛋白，4 ℃孵育过夜；二抗为HRP标记的羊抗兔IgG。滴加显影液后使用化学发光成像仪成像并运用Chemi Analysis分析软件对蛋白电泳条带灰度值进行定量分析。蛋白相对定量=目的蛋白灰度值/同标本内参灰度值，将对照的蛋白相对定量设为1。

1.2.6双荧光素酶报告基因检测 按照双荧光素酶报告基因检测系统说明书，取转染有报告基因质粒的N87细胞，加入Dual-Glo试剂孵育10 min以使细胞充分裂解，然后使用Glomax多重荧光检测仪测量萤火虫萤光素酶活性；然后加入Stop&Glo试剂孵育10 min，测量海肾萤光素酶活性。最后以海肾萤光素酶活性的测量值标准化萤火虫萤光素酶活性值。

1.2.7细胞增殖实验 选取80%满度的SGC7901细胞消化培养在96孔板，每孔加入2 000个细胞，分为WNT7b组、对照组：WNT7b组加入200 ng/ml WNT7b，对照组加入同体积PBS，每组至少设置5个复孔。然后置于5% CO2、37 ℃培养箱中分别培养24～72 h后，更换新鲜培养基，每孔加入10 μl CCK-8工作液，在培养箱中孵育4 h，在450 nm波长测定吸光度。对于SGC7901/TCF7L2、N87/shTCF7L2及其对照细胞增殖实验采用类似方法操作。

1.2.8细胞划痕实验 将N87细胞、N87/shTCF7L2细胞、SGC7901细胞、SGC7901/TCF7L2细胞分别培养在6孔板中，待细胞贴壁生长至80%满度时，用100 μl无菌移液枪头沿孔中间轻轻划过，然后用PBS洗涤细胞2次以除去漂浮细胞。其中N87细胞分为对照组与WNT7b组，WNT7b组加入200 ng/ml WNT7b，对照组加入PBS。上述细胞分别于0与20 h后拍照，观察划痕愈合情况并测量距离。

1.2.9Transwell实验 使用SGC7901细胞，消化离心后用无血清培养基重悬计数，分别将100 μl含5×103细胞悬液加入Transwell上室，对照组下室加入200 μl完全培养基，WNT7b组的下室则含有200 ng/ml WNT7b。在37 ℃、5%CO2培养箱孵育12 h后取出小室，用4 %中性福尔马林固定，棉签小心擦去上室细胞，结晶紫染色，双蒸水洗涤后用镊子取下小室底膜，50%甘油封片，10×物镜明场观察并随机选取10个视野进行计数分析。

2 结果

2.1 胃癌细胞中TCF7L2调控WNT7b基因表达通过分析过表达TCF7L2的SGC7901/TCF7L2与质粒载体对照细胞株以及敲低TCF7L2的N87/shTCF7L2与对照细胞株的PCR芯片数据，结果显示受TCF7L2调控基因表达最显著的WNT配体是WNT7b(表2)。然后通过17例临床胃癌标本检测胃癌组织TCF7L2与WNT7b的转录水平均高于配对的癌旁正常组织，二者表达呈正相关关系(图1)，结果提示WNT7b可能是TCF7L2调控的下游靶基因之一。

图1 qPCR检测胃癌组织TCF7L2和WNT7b的mRNA表达水平

2.2 WNT7b上调胃癌细胞TCF7L2表达与WNT/β-catenin信号活性使用200 ng/ml重组人WNT7b蛋白分别处理N87细胞24、48、72、96 h，当WNT7b处理时间达到24 h后可见细胞中TCF7L2的mRNA表达量上升(t=-6.124,P=0.004)，并且其表达量随着WNT7b刺激时间的延长而逐渐升高(48 h组与24 h组之间比较，t=-4.798,P=0.001)。为分析WNT7b对TCF7L2的mRNA半衰期的影响，使用2 μg/ml放线菌素D处理N87细胞以抑制新的mRNA合成，处理2 h即可显示WNT7b组比对照组的TCF7L2 mRNA水平降低(t=3.5,P=0.035)；并且随着放线菌素D处理时间的延长，WNT7b组的TCF7L2的mRNA表达量衰减速率比对照组小些，提示WNT7b增强了TCF7L2的mRNA稳定性(图2)。为分析WNT7b对TCF7L2蛋白表达的影响，使用Western blot法检测结果显示WNT7b处理的细胞TCF7L2蛋白表达水平上调，平均达到对照的4.8倍(图3A)。进一步使用双荧光素酶报告基因检测系统证实WNT7b能上调胃癌细胞β-catenin/TCF转录活性(t=-3.729,P=0.027，40 mmol/L LiCl处理作为阳性对照，图3)。这些结果提示WNT7b可能通过增强TCF7L2的mRNA稳定性而提高TCF7L2的蛋白表达水平，从而上调胃癌细胞WNT/β-catenin信号通路的活性。

表2 TCF7L2影响WNT配体表达水平

图2 qPCR法检测N87细胞中TCF7L2 mRNA水平

图3 WNT7b组增强N87细胞中TCF7L2蛋白表达和β-catenin/TCF结合活性

2.3 WNT7b与TCF7L2促进胃癌细胞的增殖为观察WNT7b对胃癌细胞增殖能力的影响，使用200 ng/ml WNT7b重组蛋白处理SGC7901细胞，24 h后检测，显示WNT7b组细胞增殖能力增强(t=-5.583,P=0.009)，且随着培养时间延长到72 h，促进细胞增殖的效果相应增强(图4A)。然后，比较过表达TCF7L2的SGC7901/TCF7L2细胞与对照细胞的增殖能力，显示培养48 h后两组细胞数之间出现显著性差异(t=-19.701,P<0.001)，过表达TCF7L2组的细胞增殖明显加快(图4B)；反之，敲低TCF7L2表达的N87细胞培养24 h后其增殖能力就出现下降(t=-7.662,P=0.007，图4C)。

2.4 WNT7b与TCF7L2增强胃癌细胞的迁移能力使用200 ng/ml WNT7b重组蛋白处理SGC7901细胞，采用划痕实验，结果显示WNT7b刺激20 h的SGC7901细胞迁移距离较长(t=-6.919,P=0.009，图5A)；Transwell实验结果显示WNT7b刺激20 h能够诱导SGC7901细胞迁移(t=-7.951,P<0. 001，图5B)。类似的，划痕实验检测显示过表达TCF7L2的SGC7901/TCF7L2细胞迁移能力增强(P<0.001)，而敲低TCF7L2表达的N87/shTCF7L2细胞的迁移能力减弱(t=-9.558,P<0.001，图5C)。

3 讨论

由于缺乏特异的生物标志物和靶向治疗药物，胃癌患者的总体生存期较短[6]。研究[7]表明WNT/β-catenin信号通路在胃肠道等多种肿瘤的发生和发展中发挥重要作用，因此针对该通路研制药物可能是治疗肿瘤的一种有效措施。WNT/β-catenin信号通路需要依赖β-catenin入核与转录因子TCF/LEF结合形成转录复合物，已知TCF/LEF家族包括TCF1、LEF1、TCF3与TCF7L2四个成员，TCF7L2是其中功能较为复杂的一个成员。尽管已有一些报道提示TCF7L2在肠和胰腺等肿瘤中的作用，但其在胃癌中的作用尚不清楚[8]。另外，WNT配体目前发现有19种，已有报道多种WNT配体与胃癌有关：如WNT1与胃癌的分期及预后有关[9]；WNT2B与胃癌淋巴结转移有关[10]；WNT5A在胃癌的进展期表达增多，可以指征不良预后[11]；WNT6表达水平与胃癌恶性进展正相关，与化疗响应负相关[12]以及WNT10B高表达和胃癌的淋巴结转移相关[13]等。WNT7b作为WNT配体家族的重要成员，早期研究表明其参与胚胎发育过程中多种器官和组织的发生[14]。近年的研究[15]表明WNT7B在约有10%的乳腺癌中高表达，且表达越高预示患者预后越差，但尚未见到在胃癌中的研究报道。

图4 WNT7b与TCF7L2促进胃癌细胞增殖

图5 WNT7b与TCF7L2增强胃癌细胞迁移能力

本课题组前期研究显示TCF7L2分子在胃癌等肿瘤中存在过度表达[4]。在此基础上，本研究通过对胃癌中受TCF7L2调控的WNT配体表达分析，显示WNT7b受影响最显著，而且在胃癌组织中WNT7b与TCF7L2的表达呈正相关关系，提示WNT7b可能是TCF7L2调控的下游靶基因之一。通过使用WNT7b重组活性蛋白刺激胃癌细胞显示WNT7b反过来能通过增强TCF7L2 mRNA的稳定性而上调TCF7L2的蛋白表达水平，进而提高了胃癌细胞WNT/β-catenin信号通路活性。细胞增殖及Transwell和划痕实验检测结果显示WNT7b具有促进胃癌细胞增殖与迁移的作用。总之，这些结果表明WNT7b与TCF7L2之间存在相互促进表达的作用，共同发挥对胃癌细胞增殖与迁移能力的调控。结果也提示WNT7b与TCF7L2有可能成为胃癌相关标记物分子与药物治疗靶点。但关于WNT7b与TCF7L2之间相互作用的具体机制及其临床应用价值还有待深入研究。