ATG5介导内皮细胞外泌体调控平滑肌细胞增殖

李征远，胡 培，周 琳，单勐也，郭兴荣

心血管疾病是一种严重威胁人类健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点[1]。全世界每年死于心血管疾病的人数高达1 500万，居各种死因首位[2-3]。冠状动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病可导致血管重构，而血管平滑肌细胞增殖和迁移是引起血管重构的重要因素之一，也是一些心血管疾病发生与发展的关键始动因素之一[4-10]。相关研究[11-13]发现，血管内皮细胞来源的外泌体水平升高可诱导血管生成。而自噬相关蛋白ATG5在外泌体形成中发挥重要作用[14-15]，但ATG5、内皮细胞外泌体及平滑肌细胞增殖之间的关系尚不明了。因此，该研究通过siRNA干扰内皮细胞ATG5蛋白的合成，研究其所产生的外泌体对平滑肌细胞增殖的影响，探讨ATG5介导下的内皮细胞与平滑肌细胞之间的信息传递，并利用共聚焦高内涵成像分析仪示踪平滑肌细胞摄取外泌体的过程。

1 材料与方法

1.1 实验材料新生儿脐带由湖北医药学院附属太和医院妇产科产妇自愿捐赠，Ⅱ型胶原酶、DMEM/F-12 培养基以及胎牛血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、DAPI以及cy3/FITC标记的荧光二抗购自武汉碧云天生物技术有限公司，FactorⅧ、CD31、Pan-Cadherin、SM22-α和α-actin抗体购自北京博奥龙免疫技术公司；Hsp70、CD9、CD63、TSG101抗体购自美国Proteintech公司；外泌体于武汉谷歌生物科技有限公司进行电镜鉴定；PKH67 MINI67-1KT购自美国Sigma公司，siRNA及转染试剂购自广州锐博生物科技有限公司；CO2培养箱、SORVALL MX150+超高速离心机购自美国Thermofisher公司；倒置相差显微镜购自日本Olympus有限公司，共聚焦高内涵成像分析仪购自美国PerkinElmer公司。

1.2 实验方法

1.2.1人脐带静脉内皮细胞的分离 20 cm健康足月剖腹产新生胎儿脐带收集于湖北医药学院附属太和医院妇产科，在无菌条件下用 PBS 冲洗干净，分离脐带中管壁薄、腔略大的脐静脉。用去掉针头的无菌注射器和 PBS 冲洗脐静脉管腔，直至流出液澄清。用止血钳夹闭脐带一端，从另一端灌注0.1% Ⅱ型胶原酶至脐静脉充盈，并用止血钳封闭脐静脉，37 ℃消化30 min，收集消化液至等体积含有10% FBS的DMEM/F-12培养基中，混匀后将收集液1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，用含10% FBS 的 DMEM/F-12 培养基重悬后再次离心，弃上清液，加入完全培养基(10% FBS+DMEM/F-12+100 μg/ml青霉素+100 μg/ml 链霉素)制成细胞悬液。将细胞悬液接种至25 cm2的细胞培养瓶中，置于5% CO2、37 ℃培养箱中静置培养，24 h 后观察细胞贴壁状况并更换培养液，以后每隔1～2 d换液。

1.2.2小鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离 将SD小鼠断颈处死，在无菌条件下取其胸主动脉，清除结缔组织，完整剥离动脉外膜并纵向剖开血管，将血管内膜向上平铺于细胞培养皿中，刮除内膜并将其剪成约1 mm2的小组织块，以0.5 cm的间距将组织块分布于25 cm2细胞培养瓶底部，轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上并注入4 ml完全培养基(20% FBS+DMEM/F-12+100 μg/ml青霉素+100 μg/ml链霉素),置于5% CO2、37 ℃培养箱中静置培养5～6 h，待组织块附着于瓶底，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养3～5 d，待有细胞从组织块周围扩展出后换液，以后每隔1～2 d换液。

1.2.3细胞鉴定 人脐静脉内皮细胞和小鼠胸主动脉平滑肌细胞的形态学特征通过倒置相差显微镜鉴定，细胞的蛋白标志物通过免疫荧光鉴定。将细胞传至12孔细胞培养板中，待细胞融合度达80%，弃培养上清液；用PBS清洗2次，免疫荧光固定液室温固定30 min；用PBS清洗3次，每次5 min；加入免疫荧光封闭液，室温封闭30 min；弃封闭液，用PBS清洗3次，每次5 min；分别加入内皮细胞特异性蛋白标志物(FactorⅧ、CD31、Pan-Cadherin)、平滑肌细胞特异性蛋白标志物(SM22-α和α-actin)一抗，4 ℃过夜孵育；用PBS清洗3次，每次5 min；加入二抗摇床避光孵育2 h；用PBS清洗3次，每次5 min；加入DAPI，室温孵育10 min，用PBS清洗3次，每次5 min；用荧光显微镜对细胞进行成像。

1.2.4细胞培养和传代 人脐静脉内皮细胞采用含有10% FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM/F-12培养基于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，每1～2 d换液。小鼠胸主动脉平滑肌细胞采用含有20% FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM/F-12培养基于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，每2～3 d换液。两种细胞的传代均待细胞融合至85%后，用PBS清洗3次，加入含有0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，当细胞皱缩成圆形时，立即加入等体积完全培养基终止消化，收集细胞于离心管中，1 500 r/min离心3 min，弃上清液，加入完全培养基，按1 ∶2的比例接种于培养瓶中培养。

1.2.5人脐静脉内皮细胞外泌体的提取与鉴定 Gibco小牛血清41 100 r/min 4 ℃离心10 h，取上层澄清液体即为无外泌体血清。用无外泌体血清配置的无外泌体完全培养基培养人脐静脉内皮细胞，收集48 h细胞培养上清液60 ml，在4 ℃环境下，于高速离心机中分别以1 200 r/min离心10 min，3 100 r/min离心10 min以及16 600 r/min离心30 min连续离心的方法去除上清液中的悬浮细胞、死细胞、细胞碎片、microvesicle及凋亡小体等杂质；用0.22 μm滤膜过滤离心后上清液；41 100 r/min超速离心70 min后弃上清液；用1 ml PBS重悬底部沉淀即为外泌体悬液。外泌体鉴定利用Western blot检测蛋白标志物Hsp70、CD9、CD63、TSG101。同时，利用电子显微镜对所提取的外泌体进行大小和完整性鉴定。

1.2.6高内涵示踪平滑肌细胞摄取外泌体 外泌体的荧光标记利用PKH67试剂盒，实验按照试剂盒操作说明进行。超速离心后得到的人脐静脉内皮细胞外泌体弃上清液，用250 μl Diluent C重悬外泌体；同时，取1 μl PKH67稀释于750 μl Diluent C中；将重悬后的外泌体和稀释后的PKH67混匀室温静置10 min；加入1 ml 0.5%的BSA以结合过量的染料；41 100 r/min超速离心70 min后弃上清液，并重悬于平滑肌细胞完全培养基中，即得到PKH67标记的外泌体。将标记后的人脐静脉内皮细胞外泌体与已贴壁生长的小鼠胸主动脉平滑肌细胞共同培养，利用共聚焦高内涵成像分析仪的40倍镜和共聚焦模式对其进行成像，分析小鼠胸主动脉平滑肌细胞对人脐静脉内皮细胞外泌体的摄取情况。

1.2.7ATG5-siRNA转染 将处于对数期生长的第8代人脐静脉内皮细胞均匀接种于6孔板，培养24 h后细胞密度达40%，实验组同时加入ATG5-siRNA1(靶序列：5′-GATTCATGGAATTGAGCCA-3′)和ATG5-siRNA2(靶序列：5′-GAAGTTTGTCCTTCTGCTA-3′)共转染，阴性对照组加入NC-siRNA转染，转染步骤参照广州锐博生物科技有限公司siRNA产品使用说明。转染48 h后分别收集细胞总蛋白，利用蛋白质印迹法检测ATG5蛋白表达情况。

1.2.8高内涵检测内皮细胞外泌体影响平滑肌细胞增殖 siRNA转染第8代人脐静脉内皮细胞48 h后换无外泌体完全培养基继续培养48 h，分别收集实验组和对照组外泌体。将处于对数期生长的第12代小鼠胸主动脉平滑肌细胞接种于24孔板中，过夜培养后换无外泌体完全培养基，并按0、100、200 μg/ml的浓度分别加入实验组和对照组外泌体。利用高内涵明场成像和DPC模式实时动态监测平滑肌细胞增殖情况。

1.3 统计学处理所有结果以及图形分别利用PowerPoint、ImageJ、Harmony4.8、GraphPad Prism 6软件处理和统计分析。组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人脐静脉内皮细胞的形态学和免疫荧光鉴定原代分离的人脐静脉内皮细胞在培养2 d后呈现明显地贴壁生长。通过倒置相差显微镜观察，单个细胞在形态上呈长梭形、多角形或椭圆形，是典型的鹅卵石样形态(图1A1)。原代细胞在培养7 d后融合度达85%(图1A2)。血管内皮细胞表面标志物Pan-Cadherin和CD31，以及血管内皮细胞内标志物Factor Ⅷ的免疫荧光结果(图1B)显示，96%的细胞呈Cy3阳性。Pan-Cadherin和CD31阳性细胞的Cy3荧光主要分布在细胞膜和细胞间的连接处上，符合Pan-Cadherind和CD31的膜蛋白的定位。Factor Ⅷ阳性细胞的Cy3荧光主要集中在细胞质中，荧光染色范围明显小于CD31和Pan-Cadherin阳性细胞。

图1 人脐静脉内皮细胞的形态学鉴定和免疫荧光结果

2.2 小鼠胸主动脉平滑肌细胞的形态学和免疫荧光鉴定在倒置相差显微镜下，小鼠胸主动脉组织块贴壁培养3 d可明显观察到有细胞(即为P0代平滑肌细胞)从组织块边缘游离出来；培养5 d，游离细胞融合度达75%；培养7 d，游离细胞融合度达90%。经过传代培养，在倒置相差显微镜下观察P1代平滑肌细胞，细胞大多呈长梭形，少数呈多角形(图2A)。血管平滑肌细胞表型标志蛋白SM22-α和α-actin的免疫荧光结果显示，95%的细胞呈Cy3阳性(图2B)。

2.3 人脐静脉内皮细胞外泌体的鉴定蛋白免疫印迹结果显示，超速离心法提取的人脐静脉内皮细胞外泌体含有外泌体标志蛋白Hsp70、TSG101、CD9和CD63(图3A)。电子显微镜下观察所提取的外泌体双层膜结构完整，直径为50～150 nm(图3B)。

2.4 平滑肌细胞摄取内皮细胞外泌体的荧光示踪在共聚焦高内涵成像分析系统(HCS)40倍共聚焦成像模式下，利用DAPI(蓝色)染色追踪小鼠胸主动脉平滑肌细胞，利用PKH67(绿色)染色追踪外泌体。高内涵记录共培养0、30、60、120、240 min时平滑肌细胞对外泌体的摄取情况。结果显示小鼠胸主动脉平滑肌细胞在共培养30 min后开始摄取PKH67标记的人脐静脉内皮细胞外泌体，共培养4 h后，平滑肌细胞摄取的外泌体明显增多(图4)。

图3 外泌体的鉴定

2.5 人脐静脉内皮细胞siRNA干扰组的ATG5蛋白合成明显降低实验组和对照组Western blot检测结果(图5)显示在siRNA转染细胞48 h后，实验组ATG5蛋白表达明显降低。

2.6 高内涵揭示ATG5介导内皮细胞外泌体调控平滑肌细胞增殖本研究利用高内涵DPC模式对随机视野中的细胞数量进行96 h的不间断统计得到平滑肌细胞的增殖曲线(图6)，表明siRNA干扰人脐静脉内皮细胞ATG5表达后分泌的外泌体在浓度达到200 μg/ml时能够明显抑制小鼠胸主动脉平滑肌细胞的增殖(图6)。通过组间分析，与对照组比较，外泌体浓度为200 μg/ml时，平滑肌细胞的增殖曲线存在显著差异(P<0.01)。

3 讨论

众所周知，除了毛细血管和毛细淋巴管外，血管壁主要由三层膜结构组成，内膜由内皮细胞构成，中膜(中动脉)主要由平滑肌细胞参与构成，外膜由疏松结缔组织组成。血管平滑肌细胞在构成血管壁、维持血管张力上发挥着重要作用，而它的异常增殖和迁移在高血压、动脉粥样硬化等疾病的发生发展过程中发挥重要作用。内皮细胞是血液与组织之间的一道具有半透膜性质的屏障，能够分泌多种活性因子，其内皮细胞损伤或功能障碍可引发系列心血管疾病。例如，内皮细胞损伤后释放的细胞因子使血液中白细胞贴壁引发炎症反应，诱导中层血管平滑肌细胞的增殖和迁移，并伴随细胞外基质的分泌和沉积，造成粥样硬化等。由此可见，内皮细胞与平滑肌细胞之间存在信息交流，相互影响，共同维持着内环境的稳定，但是其作用机制目前尚不明了。

图4 HCS示踪平滑肌细胞摄取PKH67标记的外泌体

图5 SiRNA干扰HUVEC ATG5表达的Western blot鉴定

图6 高内涵DPC模式监测VSMC增殖曲线

外泌体是包含了核酸、蛋白质等生物活性物质的小囊泡，广泛存在于血液、尿液、脑脊液、乳汁等体液之中。外泌体可通过与受体细胞的细胞膜融合或与细胞膜上特异性受体结合释放活性内容物，从而介导细胞间的信息传递，调控机体的生命活动，也与多种疾病的发生与进程密切相关。

在乳腺癌细胞的研究中发现，自噬相关蛋白ATG5通过调节乳腺癌细胞多囊泡体的pH来影响外泌体的形成，和参与微管相关蛋白的酶促级联修饰并将催化产物转移至外泌体，介导外泌体促进临近乳腺癌细胞的迁移和侵袭。敲除ATG5基因的乳腺癌细胞产生外泌体的量显著下降且外泌体内不含微管相关蛋白相关催化产物。在肺动脉血管内皮细胞的研究中发现，缺氧和炎症可诱导肺动脉内皮细胞外泌体的释放，并引起肺动脉平滑肌细胞的过度增殖和迁移。

血管平滑肌细胞的异常增殖、迁移及表型转化是心血管病，如动脉粥样硬化，发生与发展的关键始动因素之一。本研究以人脐静脉内皮细胞和小鼠胸主动脉平滑肌细胞为材料，研究siRNA干扰ATG5蛋白合成的内皮细胞所产生的外泌体对平滑肌细胞增殖的影响，同时利用共聚焦高内涵成像分析系统示踪平滑肌细胞摄取内皮细胞外泌体的过程，为探索调控平滑肌细胞异常增殖提供新的思路。

本研究结果显示，小鼠主动脉平滑肌细胞在体外培养30 min后开始摄取内皮细胞外泌体；通过siRNA干扰ATG5蛋白合成的内皮细胞所产生的外泌体在200 μg/ml浓度时可以显著抑制平滑肌细胞的增殖。但ATG5如何影响内皮细胞外泌体的产生，是否依赖于自噬，还是直接作用于外泌体形成的相关蛋白尚有待研究。另外，在siRNA干扰内皮细胞ATG5蛋白合成后，所产生的外泌体中组分是否发生质和量的改变，外泌体进入平滑肌细胞后是通过何种信号通路来调控增殖尚有待考察。

综上所述，本研究揭示了ATG5能够介导内皮细胞外泌体来调控平滑肌细胞增殖，为平滑肌细胞功能异常而导致的心血管疾病的防治提供了新的思路，但调控的具体机制有待进一步研究。