芪苈参萸益心方通过减轻炎症反应、溶酶体功能和抑制NLRP3炎症小体激活来发挥对心肌梗死大鼠的保护作用

卢 超，石孟琼，张媛媛，罗 恒，陈腊年，任俊红，舒 恒，张继红*

1三峡大学第二人民医院&宜昌市二医院；2三峡大学医学院；3三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室&三峡大学生物与制药学院，宜昌 443002

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心血管疾病的致死性表现之一。它是由于富含脂质的斑块破裂和血栓形成所导致的冠状动脉供血和心肌需求之间的不平衡造成的。这两种情况都会对心肌的某些部位造成不可逆转的损伤；临床上常见为冠状动脉病变引起心肌供血不足，造成心肌严重功能障碍，甚至坏死。在导致斑块破裂的众多致病性诱因中，炎症是MI发病的主要危险因素之一，在它MI发病中起着关键作用[1,2]。

在许多炎症途径中，心肌缺血后细胞内释放的溶酶体酶可能直接或通过激活补体途径导致细胞损伤和死亡[3]。溶酶体酶的释放在激活核苷酸结合区、富含亮氨酸家族和吡喃结构域-3(NLRP3)炎症小体[4]。此外，心肌梗死患者溶酶体酶活性的变化已被发现[5]。细胞因子是炎症介质，通过动脉粥样硬化的形成和动脉粥样硬化损伤的快速演变，触发斑块破裂和腔内血栓形成[6]。促炎细胞因子在急性心肌损伤和梗死中升高，并在MI后升高他们对与冠状动脉疾病相关的全身和血管炎症的发生和维持负有高度责任[7]。Toll样受体(TLRs)可能通过激活核因子kappa B(NF-κB)信号途径参与NLRP3炎症小体的蛋白表达，以及白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)的前体[8]。在通过包括NF-κB激活在内的多种信号转导途径释放多种炎性细胞因子中，NF-κB是NLRP3基因转录的传统启动信号。近年来研究表明NF-κB信号通路在缺血情况下调节NLRP3炎症小体的表达和活化中起着关键作用[9]。NLRP3炎症小体是一种重要的炎症调节因子，NLRP3蛋白通过PYD-PYD结构域的相互作用招募调亡相关的斑点样蛋白(ASC)，衔接蛋白ASC再通过CARD-CARD结构域的相互作用招募pro-caspase-1，结合形成炎症小体。这导致caspase-1活化，将pro-IL-1β和pro-IL-18剪切成成熟的(IL-1β和IL-18)形式，介导炎症反应[10]。此外，在氧化应激过程中，触发ROS的过度产生，促进硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)与NLRP3的结合并激活NLRP3炎症小体[11]。

芪苈参萸益心方是我们根据多年的临床经验总结出来的经验方，前期临床试验它可增加心衰患者的每分钟心排血量、提高左室射血分数、减慢因心功能不全产生的临床症状和体征[12,13]；动物实验研究发现芪苈参萸益心方对心衰所致的心肌损伤具有较好的心肌保护作用，可上调心衰大鼠心肌组织中Sirt1、胞核中Nrf2、Bcl-2蛋白表达和MnSOD、HO-1、NQO1、GCLC mRNA表达，下调Ac-FoxO1和Ac-Pgc-1α蛋白表达及上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspas-3蛋白表达，升高Bcl-2/Bax比率，并初步证实其作用机制可能与其激活Sirt1/FoxO1/Pgc-1α和Nrf2/抗氧化通路有关[14,15]。本研究拟在此基础上，围绕炎症反应、溶酶体功能和炎症小体激活来观察芪苈参萸益心方对MI大鼠的影响，探寻其可能的作用机制，为其临床应用于MI的防治提供理论基础和实验依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠120只，体质量200±20 g，由三峡大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2017-0012，分笼饲养，自由饮水和摄食。所有涉及动物使用的实验程序都是按照三峡大学动物护理委员会的指导方针和在动物伦理委员会(伦理审查批号：CTGUEAC-2019-079)的监督下进行。

1.2 药物

芪苈参萸益心方[黄芪(批号190205)30 g、葶苈子(批号181126)15 g、山茱萸(批号190127)20 g、北五加皮(批号181209)10 g、大枣(批号181213)20 g、桂枝(批号190128)15 g、煅龙牡各(批号181024、180513)15 g、丹参(批号190221)20 g]均为药典规定的药材品种，经天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)汪鋆植教授进行了鉴定，并在实验室留有药材标本。芪苈参萸益心方提取物的制备方法参见我们前期介绍的方法[15]。盐酸地尔硫卓片(天津田边制药，批号：20190829，每片30 mg)。实验时，所用药物分别用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液配成相应浓度药物混悬液，备用。

1.3 主要试剂及仪器

活性氧自由基(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒(南京建成)；β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D试剂盒(北京百奥莱博)；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-4、IL-10 ELISA试剂盒(深圳达科为)；TLR4、MyD88、iNOS、COX-2、GAPDH引物合成(荧光定量PCR引物序列见表1)，Trizol和DEPC(上海生工)；Prime Script TM RT reagent Kit、Taq DNA聚合酶(大连宝生物)；IKKβ、p-IKKβ、IκBα、p-IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18一抗(美国Santa Cruz)；β-actin一抗及二抗(武汉博士德)；组织蛋白和胞浆、胞核蛋白提取及ECL发光试剂盒(南京碧云天)；其他所用试剂均为国产分析纯。电子天平(梅特勒-托利多)；手术无影灯(上海医达)；数字展示台(日本Victor)；多导生理记录仪(美国Biopac)；涡旋仪(美国奥然)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf)；酶联免疫检测仪(瑞士Tecan)；脱水机，显微镜及图像分析系统(德国Leica)；超薄切片机(奥地利莱卡)；实时定量PCR仪(美国Illumina)；核酸测定仪(美国Thermo)；电泳仪(北京六一)。

表1 荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in quantitative real-time PCR

2 实验方法

2.1 大鼠MI的建立及给药

根据Wei等[16]报道方法制作MI大鼠模型。术后次日将模型大鼠完全随机分为模型组、芪苈参萸益心方28.8 g/kg剂量组(根据临床用药量，依据实验动物与人的体表面积换算关系计算为成人2倍量，28.8生药 g/kg)、芪苈参萸益心方57.6 g/kg剂量组(根据临床用药量，依据实验动物与人的体表面积换算关系计算为成人4倍量，57.6生药 g/kg)和盐酸地尔硫卓0.016 g/kg组(根据临床用药量，依据实验动物与人的体表面积换算关系计算约为成人2倍量，0.016 g/kg)及假手术组，每组16只。各组大鼠灌胃给予相应的药物，灌胃体积为10 mL/kg，模型组和假手术组灌胃给予相应体积的0.5% CMC-Na，每天1次，连续给药4周。

2.2 心功能的测定

末次给药的次日，实验大鼠分别用20%氨基甲酸乙酯溶液(1.5 g/kg，i.p)麻醉后，颈部切开，分离右侧颈总动脉，进行颈总动脉和左心室插管，记录颈总动脉压1次，再进入左心室，用Biopac系统记录血流动力学指标(心率：heart rate，HR；左心室收缩压：left ventricular systolic pressure，LVSP；左心室舒张末压：left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP；左室内压上升最大速率：maximal rate of the increase of left ventricular pressure，LV+dp/dtmax；左室内压下降最大速率：maximal rate of the decrease of left ventricular pressure，LV-dp/dtmin)。

2.3 标本采集及检测

2.3.1 标本采集

测定完实验大鼠心功能后，腹腔主动脉取血，分离血清，用于相关指标检测；取血完毕后，取出大鼠心脏，用生理盐水洗去残留血液，用洁净纱布吸干水分，称全心质量；每组随机选取8只大鼠心脏心肌梗死面积计算，然后随机选取3只大鼠心脏用于病理学指标检测，其余部分存储于-80 ℃冰箱，用于蛋白及基因表达检测。

2.3.2 血液中ROS含量测定

根据Hayashi等[17]介绍的方法进行血液中ROS含量检测。

2.3.3 血液中生化指标测定

按试剂盒说明书的方法测定血液中LDH、SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

2.3.4 血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-4、IL-10含量测定

按ELISA试剂盒说明书的方法测定血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-4、IL-10含量。

2.3.5 血液、心肌组织和溶酶体中溶酶体酶的测定

根据Sathish等[18]介绍的方法分离溶酶体和胞质，然后根据Nagoor等[19]介绍的方法，分别测定血液、心脏组织、溶酶体中β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、组织蛋白酶B和组织蛋白酶D的活性。

2.3.6 心脏质量指数测定及MI面积计算

全心重，计算心脏质量指数[心脏质量指数=全心重量(mg)/体重(g)]；然后随机选取每组一半大鼠的心脏，按照我们已发表文章[15]介绍的方法计算MI面积。

2.3.7 心脏组织形态学分析

将随机选取3只大鼠心脏，沿长轴从心尖到心底横切成五等份，选取中间等分，置于4%多聚甲醛中固定，乙醇脱水、石蜡包埋，切片，经HE染色后置于显微镜下观察心脏组织形态。

2.3.8 Real-time PCR检测

按照RNA提取试剂盒说明书介绍的方法提取左心室心肌组织RNA，然后将其反转录成cDNA。然后按照此反应体系[SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ (2X) 12.5 μL，PCR Forward Primer(10 μM)1 μL，PCR Reverse Primer(10 μM)1 μL，DNA模板2 μL，灭菌蒸馏水8.5 μL]在Real-time PCR扩增仪中按95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、退火30 s、72 ℃延伸20 s条件扩增40次。利用PCR仪汇出扩增曲线，进行结果分析。

2.3.9 Western blot检测

按照胞浆和胞核蛋白提取试剂盒说明书介绍的方法提取左心室心肌组织胞浆蛋白和胞核蛋白、按蛋白提取试剂盒说明书介绍的方法提取左心室心肌组织蛋白，经核酸测定仪测定蛋白含量后，用10%～15%聚丙烯酰胺凝胶在120 V、28 mA条件下电泳1.5 h，然后转膜2 h；5%脱脂牛奶封闭，滴加IKKβ、p-IKKβ、IκBα、p-IκBα、NF-κBp65、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和β-actin一抗(1∶300、1∶300、1∶400、1∶400、1∶300、1∶400、1∶400、1∶300、1∶400、1∶400、1∶300、1∶300、1∶500)，4 ℃孵育过夜；用含0.1% Tween 20的TBS冲洗后，滴加二抗(1∶1 000)后在室温下孵育2 h，然后用0.1% TBST冲洗后，X光片显影，扫描图像，用图像分析软件分析其蛋白表达。

2.4 统计学处理

3 实验结果

3.1 芪苈参萸益心方对MI大鼠心功能的影响

模型组大鼠LVSP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmin显著降低，LVEDP明显升高，与假手术组大鼠比较具有显著性差异(P<0.01)；用芪苈参萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地尔硫卓(0.016 g/kg)治疗后，各给药组LVSP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmin显著升高，LVEDP明显降低，且随着芪苈参萸益心方剂量的增加，其作用效果愈加显著，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，其中芪苈参萸益心方57.6 g/kg组作用效果强于地尔硫卓组(0.016 g/kg)，但各组之间心率没有明显的差异，结果见表2。

3.2 芪苈参萸益心方对MI大鼠血液中ROS、LDH和氧化应激指标的影响

模型组大鼠血液中LDH活性和ROS、MDA含量明显增加，SOD、CAT和GSH-Px活性显著降低，与假手术组大鼠比较具有显著性差异(P<0.01)；用芪苈参萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地尔硫卓(0.016 g/kg)治疗后，各给药组LDH活性和ROS、MDA含量明显降低，SOD、CAT和GSH-Px活性显著升高，且随着芪苈参萸益心方剂量的增加，其作用效果愈加显著，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，其中芪苈参萸益心方57.6 g/kg组作用效果强于地尔硫卓组(0.016 g/kg)，结果见表3。

表2 芪苈参萸益心方对MI大鼠心功能的影响Table 2 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on cardiac function in rats with myocardial infarction

表3 芪苈参萸益心方对MI大鼠血液中ROS、LDH和氧化应激指标的影响Table 3 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on the blood ROS,LDH and oxidativestress in rats with myocardial infarction

3.3 芪苈参萸益心方对MI大鼠血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-4、IL-10含量的影响

模型组大鼠血液中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量明显升高，抗炎因子IL-4、IL-10含量明显降低，与假手术组比较具有显著性差异(P<0.01)；用芪苈参萸益心方(28.8和57.6 g/kg)和地尔硫卓(0.016 g/kg)治疗后，上述异常改变的细胞因子得到有效逆转，且随着芪苈参萸益心方剂量的增加，其作用效果愈加显著，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，其中芪苈参萸益心方57.6 g/kg组作用效果强于地尔硫卓组(0.016 g/kg)，结果见表4。

表4 芪苈参萸益心方对MI大鼠血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-4、IL-10含量的影响Table 4 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on the blood contents of TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-18,IL-4and IL-10 in rats with myocardial infarction

3.4 芪苈参萸益心方对MI大鼠血液、心肌和溶酶体细胞器中溶酶体酶活性的影响

模型组大鼠血液、心肌中β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D活性和溶酶体细胞器胞质中β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶D的活性明显升高，溶酶体细胞器溶酶体中β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶D的活性明显降低，与假手术组比较具有显著性差异(P<0.01)；用芪苈参萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地尔硫卓(0.016 g/kg)治疗后，上述异常改变的溶酶体酶活性被有效逆转，且随着芪苈参萸益心方剂量的增加，其作用效果愈加显著，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，其中芪苈参萸益心方57.6 g/kg组作用效果强于地尔硫卓组(0.016 g/kg)，结果见表5。

表5 芪苈参萸益心方对MI大鼠血液、心肌和溶酶体细胞器中溶酶体酶活性的影响或n=8)Table 5 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on activities of lysosomal in the blood,heart tissue and subcellular fractionsin rats with myocardial infarction or n=8)

3.5 芪苈参萸益心方对MI大鼠心脏重量指数和心肌梗死面积的影响

由图1和图2可见，模型组大鼠心脏重量指数和心肌梗死面积明显增加，与假手术组比较具有显著性差异(P<0.01)；用芪苈参萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地尔硫卓(0.016 g/kg)治疗后，心脏重量指数和心肌梗死面积明显降低，且随着芪苈参萸益心方剂量的增加，其作用效果愈加显著，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，其中芪苈参萸益心方57.6 g/kg组作用效果强于地尔硫卓组(0.016 g/kg)。

3.6 芪苈参萸益心方对MI大鼠心脏组织形态学的影响

如图3所示，假手术组大鼠心肌组织结构和形态正常，核正常，无炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌组织表现为广泛的心肌结构紊乱和破裂，心肌纤维呈坏死和波浪状，细胞核消失；用芪苈参萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地尔硫卓(0.016 g/kg)治疗后，可显著减少坏死程度和炎性细胞浸润，且随着芪苈参萸益心方剂量的增加，其作用效果愈加显著。

3.7 芪苈参萸益心方对MI大鼠心肌中TLR4、MyD88、iNOS、COX-2 mRNA表达的影响

模型组心肌组织中TLR4、MyD88、iNOS、COX-2 mRNA表达明显升高，与假手术组比较具有显著性差异(P<0.01)；用芪苈参萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地尔硫卓(0.016 g/kg)治疗后，TLR4、MyD88、iNOS、COX-2 mRNA表达明显降低，且随着芪苈参萸益心方剂量的增加，其作用效果愈加显著，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，其中芪苈参萸益心方57.6 g/kg组作用效果强于地尔硫卓组(0.016 g/kg)，结果见表6。

图1 芪苈参萸益心方对MI大鼠心脏外观形态的影响Fig.1 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on cardiac appearance and morphology in rats with myocardial infarction注：1：假手术组；2：模型组；3：芪苈参萸益心方28.8 g/kg组；4：芪苈参萸益心方57.6 g/kg组；5：地尔硫卓组。Note:1:Sham group;2:Model group;3:Qili Shengyu Yixin Formula 28.8 g/kg group;4:Qili Shengyu Yixin Formula 57.6 mg/kg group;5:Diltiazem group.

图2 芪苈参萸益心方对MI大鼠心脏重量指数和心肌梗死面积的影响Fig.2 Effects of Qili Shengyu Yixin Formula on the cardiac weight index and myocardial infarct size in rats with myocardial infarction

图3 芪苈参萸益心方对MI大鼠心脏组织形态学的影响(HE染色)Fig.3 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the histomorphology in rats with myocardial infarction (Hematoxylin and eosin)注：A：假手术组；B：模型组；C：芪苈参萸益心方28.8 g/kg组；D：芪苈参萸益心方57.6 g/kg组；E：地尔硫卓组。Note:A:Sham group;B:Model group;C:Qili Shengyu Yixin Formula 28.8 g/kg group;D:Qili Shengyu Yixin Formula 57.6 mg/kg group;E:Diltiazem group.

表6 芪苈参萸益心方对MI大鼠心肌中TLR4、MyD88、iNOS、COX-2 mRNA表达的影响Table 6 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the mRNA expressions of TLR4,MyD88,iNOS and COX-2in myocardial tissue of rats with myocardial infarction

3.8 芪苈参萸益心方对MI大鼠心肌中NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路相关蛋白表达的影响

模型组心肌中胞浆p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和胞核NF-κBp65蛋白表达明显上调，p-IKKβ/IKKβ和p-IκBα/IκBα比值明显增加，胞浆NF-κBp65蛋白表达明显下调，与假手术组比较具有显著性差异(P<0.01)；用芪苈参萸益心方(28.8、57.6 g/kg)和地尔硫卓(0.016 g/kg)治疗后，心肌组织中胞浆p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和胞核NF-κBp65蛋白表达明显下调，p-IKKβ/IKKβ和p-IκBα/IκBα比值明显减少，胞浆NF-κBp65蛋白表达明显上调，且随着芪苈参萸益心方剂量的增加，其作用效果愈加显著，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。各组间IKKβ和IκBα蛋白表达无显著性差异(P>0.05)，结果见表7～9和图4。

表7 芪苈参萸益心方对MI大鼠心肌中IKK复合物中相关蛋白表达的影响Table 7 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the IKK complex related protein expressions inmyocardial tissue of rats with myocardial infarction

表8 芪苈参萸益心方对MI大鼠心肌中NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路相关蛋白表达的影响Table 8 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the protein expressions of NF-κB/NLRP3 signaling pathwayin myocardial tissue of rats with myocardial infarction

表9 芪苈参萸益心方对MI大鼠心肌中炎症因子蛋白表达的影响Table 9 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the protein expressions of inflammatory factors in myocardialtissue of rats with myocardial infarction

图4 芪苈参萸益心方对MI大鼠心肌中NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路相关蛋白表达的影响Fig.4 Effect of Qili Shengyu Yixin Formula on the protein expressions of NF-κB/NLRP3 signaling pathway in myocardial tissue of rats with myocardial infarction注：1：假手术组；2：模型组；3：芪苈参萸益心方28.8 g/kg组；4：芪苈参萸益心方57.6 g/kg组；5：地尔硫卓组。Note:1:Sham group;2:Model group;3:Qili Shengyu Yixin Formula 28.8g/kg group;4:Qili Shengyu Yixin Formula 57.6 mg/kg group;5:Diltiazem group.

4 讨论

MI后炎症是近年来心血管研究的热点，它影响缺血心脏的重塑过程，从而严重影响患者的临床预后。适度的炎症反应可以缩小心肌梗死范围，促进受损心肌的修复，然而过度炎症可能产生有害影响，并可能导致与心力衰竭风险增加相关的不良心室重塑[20]。因此，减轻炎症反应在改善MI心肌损伤，促进心肌功能恢复中具有重要意义。近年来，我们在临床试验和动物的实验研究时发现，芪苈参萸益心方对心肌损伤具有较好的治疗作用，并证实抑制心肌细胞凋亡和氧化应激损伤恢复受损心肌功能可能是其发挥作用机制之一[14,15]。本实验将在此基础上，通过冠脉结扎诱导的大鼠MI模型，观察芪苈参萸益心方对炎症反应、溶酶体功能和炎症小体活性的影响，在此基础上探寻其可能的作用机制，为此我们进行了本实验。实验结果表明，芪苈参萸益心方可显著改善MI大鼠心功能、降低心脏重量指数和梗死面积，减少心肌坏死程度和炎性细胞浸润；降低血清、心肌中β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D活性和溶酶体细胞器胞质中β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶D的活性，升高溶酶体细胞器溶酶体中β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶D的活性；降低血液中LDH活性、ROS、MDA和TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量，升高血液中SOD、CAT和GSH-Px活性和IL-4、IL-10含量；下调心肌中iNOS、COX-2、TLR4、MyD88 mRNA表达，下调心肌胞浆中p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和胞核NF-κBp65蛋白表达，降低p-IKKβ/IKKβ和p-IκBα/IκBα比值，上调心肌胞浆中NF-κBp65蛋白表达。上述结果表明，芪苈参萸益心方可通过抑制炎症反应、溶酶体功能和炎症小体激活功能来发挥对MI大鼠的治疗作用。

众所周知，ROS的产生是细胞正常代谢的一部分，此时产生的ROS会被细胞内的内源性抗氧化系统所清除，但是当细胞缺氧所致氧化应激会引起ROS的过量产生和异常积累，会导致膜脂类、蛋白质、碳水化合物和DNA的氧化损伤。因此ROS也被认为是心肌损伤的关键因子[21]。ROS攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化，破坏细胞膜的完整性，导致LDH等心肌酶渗漏，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映细胞膜结构和功能上受到损伤的程度[22]。在本研究中，MI大鼠血液中ROS、MDA含量和LDH活性较假手术组显著升高，SOD、GSH-Px、CAT活性明显降低。上述结果提示MI引起的心肌损伤导致氧化应激发生。芪苈参萸益心方可显著升高血液中SOD、GSH-Px和CAT活性，降低LDH活性和ROS、MDA含量，减轻心肌细胞的脂质过氧化，进而保持细胞膜结构和功能的完整性。总之，芪苈参萸益心方主要通过提高抗氧化酶活性来保护MI所致的心肌损伤。

心肌缺血时产生的ROS除了破坏细胞膜的细胞膜结构和功能外，还可与溶酶体脂质双层膜反应，破坏溶酶体膜的稳定性，导致溶酶体破裂，酸性水解酶和组织蛋白酶释放到胞浆和循环中。酸水解酶从溶酶体释放到胞质中，导致缺血心脏的心肌细胞损伤和死亡[23]。在实验中，模型组大鼠血清、心肌中β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D活性和溶酶体细胞器胞质中β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶D的活性明显升高，溶酶体细胞器溶酶体中β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶D的活性明显降低；用芪苈参萸益心方治疗后可有效抑制β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D从溶酶体渗漏。

越来越多的证据表明炎症在MI的病理生理过程中起着至关重要的作用[24]。在缺氧条件下，心肌氧化应激产生H2O2、超氧阴离子和羟基自由基等一方面被心肌细胞膜上的模式识别受体(PRR)TLR4识别，随后募集下游的信号蛋白MyD88，形成MyD88-TLR4复合体，MyD88的死亡结构域与IRAK的死亡结构域结合从而依次引起IRAK1和IRAK4的自磷酸化，随后离开MyD88-TLR4复合体而与TRAF6结合，导致TRAF6激活，而TRAF6又激活TAK1；TAK1激活IKK复合体，IKK复合体被激活后可使其下游分子IκB降解，从而释放NF-κB的2个亚基：p50和p65，并使p65亚基磷酸化，磷酸化p65在有核定位信号p50的帮助下进入细胞核，从而启动炎症反应免疫相关基因转录，表达与分泌IL-6、TNF-α炎症因子及无活性的pro-IL-1β、pro-IL-18和NLRP3产生，完成炎症反应信号的传递，参与炎性激活、细胞凋亡等病理过程[25,26]。另一方面进入心肌细胞后可被细胞质中PRR：NLRP3所识别并促进细胞内TXNIP与硫氧蛋白分离，然后与NLRP3结合，使NLRP3募集ASC和pro-caspase-1，完成无活性的NLRP3炎症小体组装；同时还可引起线粒体损伤和溶酶体破裂，导致线粒体内容物(mtROS和mtDNA)的释放或暴露、溶酶体释放组织蛋白酶B，促进NLRP3炎症小体结合并将其激活，诱导pro-caspase-1自我剪切活化，活化的caspase-1使pro-IL-1β、pro-IL-18剪切为活化的IL-1β、IL-18，活化的IL-1β、IL-18刺激心肌细胞，通过自分泌/旁分泌系统分泌多种更多炎症介质、炎症因子，形成恶性循环[2,27,28]。由此可见，TLR4/NF-κB通路及下游NLRP3炎症小体途径掌控着MI炎症反应，靶向此通路可为MI的治疗提供新思路。实验中，我们发现MI模型大鼠心肌组织中TLR4、MyD88、iNOS、COX-2、mRNA和心肌组织胞浆中p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18和胞核NF-κBp65蛋白表达明显上调，p-IKKβ/IKKβ和p-IκBα/IκBα比值明显增加，胞浆NF-κBp65蛋白表达明显下调；血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量明显升高，IL-4、IL-10含量明显降低；用芪苈参萸益心方治疗后上述异常表达得到了有效遏制，实验提示芪苈参萸益心方可通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路炎性激活，进而抑制炎症因子发生发挥对MI的治疗作用。

综上所述，芪苈参萸益心方对冠脉结扎诱导的大鼠MI有显著治疗作用，其作用机制可能与其增强内源性抗氧化系统功能、缓解MI后氧化应激及减轻炎症反应、纠正溶酶体功能障碍和抑制NLRP3炎症小体激活有关。本研究为芪苈参萸益心方治疗MI提供了分子生物学依据。