HPLC法测定头孢拉定胶囊强制降解产物的研究

2020-12-03张继红郑露盼黄道明

药品评价 2020年16期

张继红，郑露盼，黄道明

上饶市食品药品检验检测中心，江西上饶 334000

头孢拉定为第一代半合成头孢菌素，耐酸，可以口服，吸收好，血药浓度较高，特别是耐β 内酰胺酶，对耐药性金葡菌及其它多种对广谱抗生素耐药的杆菌等有迅速而可靠的杀菌作用［1］，临床主要用于呼吸道、泌尿道、皮肤和软组织等的感染。当前药物安全性问题已成为全球越来越关注的焦点，而有关物质研究及控制是保证药品安全的关键要素之一，各国药品质量标准对有关物质检查的要求也越来越高［2-10］。在药品质量与降解程度检测中，有关物质是一项重要的反映指标，为有效控制产品质量，对生产、运输及储藏过程中可能产生的有关物质进行控制，本文采用高效液相色谱法（HPLC）［11-13］对头孢拉定胶囊的强制降解产物进行测定研究，能为头孢拉定制剂稳定性研究提供重要依据，为药品的生产，运输及贮存条件提供重要参考［14,15］。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（日本岛津公司）；电子天平（sartorius公司）；恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；pH计（Thermo公司）。

1.2 试剂试药

头孢拉定胶囊（A企业，批号：1812102，250 mg/粒）；头孢拉定对照品（批号：130427-201107，含量88.3%），头孢氨苄对照品（批号：130408-201411，含量94.4%），7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸对照品（批号：130416-201006，含量98.5%），双氢苯甘氨酸对照品（批号：130434-201403，含量94.7%），以上均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯（美国avantor公司），其他均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent C18（250 mm × 4.6 mm，5 µm），以1%磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH值到4.5）∶乙腈（93∶7）为流动相，检测波长为254 nm,流速为0.8 mL/min，柱温30 ℃，进样量为20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液精密称取头孢拉定胶囊内容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液精密称取双氢苯甘氨酸10.87 mg、头孢拉定12.15 mg、头孢氨苄10.29 mg、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸11.53 mg,置100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为混合对照溶液。

2.2.3 自身对照溶液精密量取供试品溶液1 mL，置于200 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为自身对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2.2”项下溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，出峰顺序为7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸、双氢苯甘氨酸、头孢氨苄和头孢拉定，各峰的理论塔板数分别是5 476、15 923、17 942和18 723，分离度分别为2.6、38.4和12.0，均符合要求。

2.4 破坏性试验

考察本品在酸、碱、氧化、高温、光照和紫外线条件下的降解情况。由降解试验结果得知本品在高温、光照和紫外线条件下基本上没有明显的降解杂质，而在酸、碱和氧化条件下有明显的降解杂质，根据各降解条件下出现的杂质峰检出情况及相对保留时间来确定杂质峰的归属。

2.4.1 酸破坏精密称取头孢拉定胶囊内容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加1 mol/L的盐酸溶液1 mL、50 ℃水浴3 h，用氢氧化钠溶液调pH值近中性，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，作为酸破坏样品。

2.4.2 碱破坏精密称取头孢拉定胶囊内容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加0.05 mol/L的氢氧化钠溶液1 mL、50 ℃水浴3 h，用盐酸溶液调pH值近中性，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，作为碱破坏样品。

2.4.3 氧化破坏精密称取头孢拉定胶囊内容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加0.5%的过氧化氢溶液1 mL、放置1 h，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，作为氧化破坏样品。

2.4.4 高温破坏精密称取在80、100、120 ℃的烘箱中放置1、3和5 h的头孢拉定胶囊内容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为高温破坏样品。

2.4.5 光照破坏精密称取在4 500 lx光照条件下照射1、3、5和7 d的头孢拉定胶囊内容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为光照破坏样品。

2.4.6 紫外线破坏精密称取在254 nm紫外线条件下照射1 h、5 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d的头孢拉定胶囊内容物25 mg，置于25 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为紫外线破坏样品。强制降解试验结果显示，头孢拉定胶囊粉末在高温、光照及紫外线条件下相对稳定，无明显的降解产物产生，主峰面积无明显变化，而在酸、碱及氧化条件下均有明显的降解产物生成,主峰之后基本无明显的降解产物生成。在酸破坏试验中，主峰降解12%左右，出现明显的8个杂质峰；在碱破坏试验中，主峰降解19%左右，出现明显的8个杂质峰；在氧化破坏试验中，主峰降解18%左右，出现明显的9个杂质峰，主要降解产物图谱见图1。

2.5 稳定性试验

取“2.2.1”项下溶液，室温放置0、1、3、5、7、9、12、24 h，按“2.1”项下色谱条件测定，记录各成分峰面积，计算头孢拉定和头孢氨苄峰面积的RSD，结果分别为0.3%和0.3%，表明供试品在24 h内稳定，可满足本品测定的要求。

2.6 检出限与定量限

精密称取头孢拉定对照品适量，用流动相溶解并逐级稀释，按“2.1”项下色谱条件测定，以信噪比S/N=3和S/N=10计，测得头孢拉定检出限和定量限分别约为0.01 ng/mL和0.03 ng/mL。

2.7 线性关系

精密称取头孢拉定对照品适量，用流动相溶解制成含头孢拉定1 mg/mL的溶液，分别逐级稀释，记录色谱图，以峰面积（Y）对头孢拉定浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y=1×107X+56 756（相关系数为r=0.999 9），表明头孢拉定浓度与色谱峰面积在1 µg/mL～100 µg/mL范围内线性关系良好。

2.8 精密度试验

取“2.2.1”项下溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，计算头孢拉定和头孢氨苄峰面积的RSD，结果分别为0.4%和0.3%，表明仪器的精密度良好。

2.9 重复性试验

取同一批次样品，按“2.2.1”项下制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件测定，头孢氨苄、其他单个最大杂质和总杂质测量均值为1.8%、0.7%和0.9%，RSD分别为0.8%、1.0%和0.9%，表明该方法重复性良好。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

通过对双氢苯甘氨酸、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸、头孢氨苄、孢拉定及降解杂质进行DAD全波长扫描检测，除了双氢苯甘氨酸在220 nm处有最大吸收，其它均在254 nm附近有较大吸收，故以254 nm作为降解产物的检测波长。

3.2 耐用性

选择3个不同品牌的C18色谱柱，分别在不同的高效液色谱仪上进行耐用性考察，结果峰形和分离度效果差别不大，本法耐用性良好。

3.3 强制降解条件的选择

在酸强制降解试验中，通过添加不同浓度（0.1、0.5、1.0和2.0 mol/L）、不同体积（1和2 mL）、放置不同时间（0.5、1、2、3和5 h）和不同温度（室温和50 ℃）的盐酸溶液作为降解条件，以主峰降解比例及能检出的杂质峰为依据，最终选择加1 mol/L的盐酸溶液1 mL、50 ℃水浴3 h为酸降解试验条件；在碱强制降解试验中，通过添加不同浓度（0.1、0.05和0.01 mol/L）、不同时间（0.5、1、2、3和5 h）、不同体积（1和2 mL）和不同温度（室温、50和70 ℃）的氢氧化钠溶液作为降解条件，和不同浓度（0.1、0.3和0.5 mol/L）、不同时间（0.5、1、2、3和5 h）、不同体积（1和2 mL）和不同温度（室温、50 ℃、70℃）的碳酸氢钠溶液作为降解条件，以主峰降解比例及能检出的杂质峰为依据，最终选择加0.05 mol/L的氢氧化钠溶液1 mL、50 ℃水浴3 h为碱降解试验条件；在氧化强制降解试验中，通过添加不同浓度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0% 及10.0%）的过氧化氢溶液1 mL和不同的放置时间（1、3、5 h）的降解条件，以主峰降解比例及能检出的杂质峰为依据，最终选择加0.5%的过氧化氢溶液1 mL、放置1 h为氧化降解试验条件；在高温（置80、100和120 ℃的烘箱中放置1、3和5 h）、光照（4 500 lx照射1、3、5、7和10 d）和紫外线（254 nm紫外线下照射1 h、5 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d）强制降解条件下，样品主峰面积基本没变化，也无明显的杂质峰。

3.4 流动相的选择

《中国药典》中采用水-甲醇-3.86%醋酸钠溶液-4%醋酸溶液（1 564∶400∶30∶6）为流动相，此流动相比较复杂，本文考察了1%磷酸二氢铵∶乙腈、1%磷酸二氢铵 :甲醇、0.23%磷酸二氢铵∶乙腈、0.23 %磷酸二氢铵 :甲醇、0.72%醋酸钠∶乙腈、0.72%醋酸钠∶甲醇、0.27%磷酸二氢钾∶乙腈、0.27%磷酸二氢钾∶甲醇八种流动相，同时水系流动相分别调不同的pH值进行试验，结果显示，当1%磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH值到4.5）∶乙腈为（93∶7）时，主峰出峰时间适当，峰型对称，且各杂质峰能达到有效分离，是较理想的流动相。