加压流体萃取-液相色谱法测定土壤中4种新烟碱类杀虫剂

李清芳，邓 茂，姚 靖，黄晓容

(重庆市黔江区生态环境监测站，重庆 黔江 409000)

0 引言

新烟碱类杀虫剂是一类新兴的高效植物源杀虫剂，通过选择性控制昆虫神经系统烟碱型乙酰胆碱酶受体，阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，导致害虫出现麻痹进而死亡，对同翅目、鞘翅目、双翅目和鳞翅目等害虫具有良好的防治作用。该类杀虫剂自20世纪80年代商品化以来，发展迅速，近年已占据杀虫剂市场约四分之一的份额[1-2]。

农药进入土壤后会吸附在土壤颗粒表面，并于土壤中其它物质发生反应，导致土壤中的微生物死亡，从而破坏土壤结构，导致土壤肥力降低。同时，人类长时间食用农药残留量超标的农产品或食物，会对人类肌体造成长期损害，导致慢性中毒甚至死亡[3]。

目前，有关新烟碱类农药残留分析的研究较多[4-7]，新烟碱类杀虫剂的检测方法主要有气相色谱法[8-9]、液相色谱-质谱法[10-11]、高效液相色谱法[12-13]和分光光度法[14-15]等。

新烟碱类杀虫剂因挥发性低、极性高、存在基质效应等原因不适于直接采用气相色谱进行分析，液相色谱-质谱联用常用来定性、定量分析新烟碱类农药，但该方法仪器昂贵，不适合实验室的常规检测[13,16]，高效液相色谱法具有普及率高、定量准确、兼容性好等特点，是新烟碱类杀虫剂的主要检测方法。新烟碱类杀虫剂常用的前处理主要为固相萃取，加速溶剂萃取、基质固相分散、分散固相萃取、微波辅助萃取、超临界流体萃取、液相微萃取等[17-20]。由于农产品样品的多样性和复杂性，采用一种高效的前处理萃取方式是至关重要的。加压流体萃取法是一种在提高温度和压力的条件下，用有机溶剂萃取的自动化方法，是目前较为先进的处理方法。因其溶剂使用量相对少、提取速度较快等优点而被广泛使用。

本文对土壤中新烟碱类杀虫剂检测方法进行优化，建立了加压流体萃取-高效液相色谱同时测定烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫啉4种新烟碱类杀虫剂的检测方法。

1 实验过程

1.1 仪器及试剂

安捷伦1200液相色谱仪，配备紫外检测器(VWD)(HPLC/VWD)和自动进样器(DE71366524)；Agilent Zorbax Eclipse Xdb-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；SCIENTZ-18N冷冻干燥机(16-0627)；SQP赛多利斯电子天平；ASE 350加压流体萃取仪(15112000)；Hei-uPPrecision真空旋转蒸发仪(200433080913)；EFAA-DC24-RT防腐性24位氮吹仪(B8560003)。

乙腈(HPLC级，上海安谱实验科技股份有限公司)；二氯甲烷(HPLC级，默克股份两合公司)；乙腈(HPLC级，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫啉4种标准物质均为有证标准物质(美国Accustandard公司)；Poly-Sery HLB固相萃取小柱(60 mg，3 mL，上海安谱实验科技股份有限公司)。

1.2 样品制备与前处理

1.2.1 制样

新鲜采集的土壤样品迅速送回实验室进行冷冻，经冷冻干燥后，用φ=15 cm玛瑙研钵全量碾磨后，用四分法过20目筛备用。

空白实验用石英砂替代土壤样品，即为土壤空白样品。

1.2.2 加压流体萃取

34 mL萃取池组装完成后，称取10 g土壤样品或石英砂与适量硅藻土掺拌均匀，将样品全部转入萃取池中，用二氯甲烷和乙腈(V∶V=1∶1)混合溶液做为萃取溶剂。设置加压流体萃取仪萃取温度为100 ℃，上机萃取。收集萃取液。预加热平衡时间5 min，静态萃取时间5 min，静态萃取次数设置为2次，溶剂淋洗体积设置为60%池体积，氯气吹扫时间设置为60 s。

1.2.3 旋蒸

将加压流体萃取液，在40 ℃恒温条件下进行梯度旋蒸，根据冷凝管蒸汽高度调整真空度，蒸至0.5～1.0 mL左右。

1.2.4 净化

将Poly-Sery HLB固相萃取柱作为净化柱，将其固定在固相萃取装置上，依次用5 mL二氯甲烷和5 mL乙腈溶液进行活化，将浓缩液转移至固相萃取柱中，用1 mL二氯甲烷和乙腈(V∶V=1∶1)混合溶液洗涤旋蒸瓶3次，一并转入固相萃取柱中，用5 mL二氯甲烷和乙腈(V∶V=1∶1)混合溶液进行洗脱，待洗脱液浸满净化柱后关闭流速控制阀，浸润3 min，再打开控制阀，接收洗脱液至完全流出。

1.2.5 浓缩

用氮吹法浓缩法将洗脱液浓缩至约1 mL，再加入3 mL乙腈，在浓缩至1 mL以下，并用乙腈准确定容至1.0 mL后待测。

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Xdb-C18柱；流动相：乙腈:水(V∶V=40∶60)；流动相流速：0.9 mL/min；柱温：40 ℃，波长条件：0～5 min，270 nm；5～8 min，252 nm；样品进样量：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 分离效果

在不含待测物的土壤空白样品中，分别添加一定含量的烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫啉4种标准物质，按照本文样品前处理步骤进行处理，用HPLC/VWD进行测定，根据4种物质的性质和分子结构，采用乙腈水溶液作为流动相，获得4种新烟碱类杀虫剂的色谱分离图(见图1)，从图1可知，色谱图基线平稳，峰形尖锐，4种新烟碱类杀虫剂可以达到满意的分离效果，分离度均大于2。4种物质出峰顺序依次为烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉和噻虫啉，它们的保留时间(Retention time,RT)分别为RT烯啶虫胺=3.075 min、RT噻虫嗪=3.591 min、RT吡虫啉=4.461 min和RT噻虫啉=5.828 min。

图1 4种新烟碱类杀虫剂分离出峰图Fig.1 The peak figure of the four neonicotinoids insecticides

2.2 线性范围

采用浓度均为100 mg/L的烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫啉标准溶液，用乙腈稀释配制成0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L的系列浓度。按1.3的色谱条件对配制好的系列标准溶液进行测试，以峰面积为纵坐标，样品浓度为横坐标绘制标准曲线。结果见图2所示。 4种新烟碱类杀虫剂标准曲线能满足测试要求(相关系数均>0.999 7)，其标准曲线方程和相关参数见表1所示。

图2 4种新烟碱类杀虫剂标准曲线Fig.2 The standard curve of the four neonicotinoids insecticides

表1 4种新烟碱类杀虫剂标准曲线参数Tab.1 The standard curve parameters of the four neonicotinoids insecticides

2.3 方法检出限

不少研究以仪器检出限代替方法检出限，但仪器检出限反映的是不同仪器性能差异，方法检出限才能客观反映样品前处理及测定分析的全过程[21]。按照本研究设定的样品前处理步骤及仪器测试方法，准确称取10 g左右的石英砂作为基体，配制质量浓度为0.015 mg/kg的样品，进行前处理和液相色谱测试。根据HJ 168-2010[22]，对样品重复测量n=7次，计算7次平行测定的标准偏差(S)，t(6，0.99)=3.143，则检出限=3.143×S，见表2。

由表2得知：烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫啉的检出限分别为0.004 mg/kg、0.005 mg/kg、0.003 mg/kg、0.003 mg/kg。

表2 4种新烟碱类杀虫剂方法检出限Tab.2 The detection limits of the analysis method

2.4 加标回收率试验

称取10 g左右的石英砂，加入一定含量的新烟碱类杀虫剂，按照本文样品前处理步骤及仪器测试条件进行测试，计算各物质各组浓度的加标回收率和相对标准偏差。加标回收试验设计见表3，每一种新烟碱类杀虫剂做3组不同浓度的加标回收试验，其加标量分别为0.50 μg、1.00 μg、5.00 μg，使土壤样品质量浓度分别为0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.5 mg/kg，结果表明，烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉和噻虫啉平均添加回收率分别在70.6%～84.7%、83.6%～89.1%、85.9%～126.9%、81.2%～120.8%之间。

表3 4种新烟碱类杀虫剂加标回收率试验Tab.3 The experimental parameters of the standard addition recovery

从表3可看出，烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫啉的3个添加水平的平均回收率均在70%以上，5次测试的相对标准偏差均小于10%，说明该方法准确性和精密度都很高。

3 结论

本文建立了烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫啉4种新烟碱类杀虫剂在土壤中的残留分析方法，结果表明，采用加压流体萃取-高效液相色谱法分析土壤中烯啶虫胺、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫啉4种新烟碱类杀虫剂，前处理简单、省时省力，使用溶剂较少，对环境污染小。方法灵敏度高，各组分之间不产生相互干扰，检出限分别为0.004 mg/kg、0.005 mg/kg、0.003 mg/kg、0.003 mg/kg。研究结果表明，方法的加标回收率在70.6%～126.9%之间，相对标准偏差在1.9%～9.5%之间，准确度和精密度都能够满足土壤中农药残留检测要求。