沉香叶的薄层色谱鉴别及HPLC含量测定*
2020-12-02李锦云柯泽涛谢晨星廖锦红李永辉
李锦云,柯泽涛,谢晨星,廖锦红,李永辉
(1 海南森祺制药有限公司,海南 海口 570216;2 海南医学院药学院,海南 海口 571199)
沉香为海南省常用的中草药,收载于《中华本草》[1],沉香有抗炎、镇痛、降血糖的功效,主治便秘、肠梗阻、出血及脑缺血等症。沉香叶为白木香Aquilariasinensis.的非药用部位,主要分布于海南和广东省的低海拔山地、丘陵以及路边疏林中。其性味归经、功能主治和用法用量尚无报道。化学成分研究表明,沉香叶中含有黄酮、多酚、多糖、氨基酸类成份[2]。已有文献报道芫花素作为沉香叶的含量测定指标[3]。
现代药理学研究[4-8]表明,沉香叶在镇痛、抗炎、平喘、促进小肠推进和降血糖方面,具有同沉香药材相似的药效功效,沉香叶高剂量组(相当于沉香药材的4倍剂量)与沉香药材药效结果最相近。研究表明沉香叶安全性较好[9],因此建立沉香叶的质量标准,对于扩大白木香的药用资源,促进沉香产业的发展具有重要的意义。
1 仪器与材料
LC-20A型液相色谱仪(包括四元泵、自动进样器、柱温箱、检测器、工作站),日本岛津公司;SartoriusBSA124S-CW电子分析天平,北京赛多利斯仪器有限公司;DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱,上海一恒科技有限公司;KQ-250DB数控超声仪,昆山市超声仪器有限公司。
乙腈(色谱纯),美国Fisher公司;水为超纯水,其他试剂均为分析纯。硅胶预制板(批号17110114),烟台化学工业研究所。芫花素对照品(纯度>98%,批号111899-201001),中国食品药品检定研究院;10批沉香叶药材均为产地收集,由海南医学院田建平教授鉴定确定为瑞香科植物沉香属白木香Aquilariasinensis的叶。
2 方法与结果
2.1 性 状
本品多破碎,完整叶片展平后呈椭圆形或卵形,长6~12 cm,宽2~5 cm。表面黄绿色或黄褐色,微有光泽,先端渐尖,基部楔形或广楔形,边缘光滑,具短叶柄。质脆,搓之易碎。气芳香,味微苦。
2.2 薄层鉴别
2.2.1 对照药材溶液的制备
取沉香叶对照药材1 g,加甲醇50 mL,超声处理20 min,滤过,滤液作为供试品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
取本品粉末1 g,加甲醇50 mL,超声处理20 min,滤过,滤液作为供试品溶液。
2.2.3 薄层色谱条件及结果
照薄层色谱法(通则)实验,吸取供试品溶液和对照药材溶液各7 μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以15%的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
图1 沉香叶药材的薄层鉴别
2.3 含量测定方法的研究
2.3.1 色谱条件和系统适用性
图2 芫花素(A)和沉香叶(B)的HPLC图
优化后的的色谱条件为(岛津VP-ODS 150 mm×4.6 mm色谱柱;流动相为0.4%磷酸水-乙醇(38:62);流速1.0 mL/min;检测波长:332 nm;柱温:40 ℃),分别对空白溶剂(甲醇)、对照品溶液和样品溶液(批号20190401)进行进样分析,结果显示芫花素在样品中得到了较好的分离,理论塔板数为5248,分离度为7.19,溶剂对样品无干扰。
2.3.2 对照品溶液的制备
取芫花素对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含0.022 mg的溶液,即得。
2.3.3 供试品溶液的制备
取本品粉末(过二号筛)约1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入50%乙醇50 mL,密塞,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.3.4 测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液,注入液相色谱仪,测定,即得。
2.3.5 线性关系考察
取对照品溶液(0.022 mg/mL),采用序列进样法依次进样2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL,以进样量(ng)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明芫花素在44~308 ng范围内线性关系良好,线性回归方程为Y=4388X-7673,R=0.9999。
2.3.6 精密度考察
精密称取沉香叶药材粉末(20190401,过二号筛)1.0 g,置具塞锥形瓶中,加入50%乙醇50 mL,称定重量,超声提取30 min,取出,放冷,以50%乙醇补足减失的重量,滤过,取续滤液连续进样8次,记录芫花素的峰面积,并计算RSD值以考察精密度。结果表明:芫花素峰面积的RSD为0.92%,说明仪器精密度良好。
2.3.7 稳定性考察
精密称取沉香叶药材粉末(20190401,过二号筛)1.0 g,置具塞锥形瓶中,加入50%乙醇50 mL,称定重量,超声提取30 min,取出,放冷,以50%乙醇补足减失的重量,滤过,取续滤液分别与0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和14 h进样,记录芫花素的峰面积,并计算RSD值以考样品稳定性。结果表明:芫花素在14 h内稳定,峰面积的RSD为2.84%。
2.3.8 重复性考察
精密称取沉香叶药材粉末(20190401,过二号筛)6份,每份约1.0 g,置具塞锥形瓶中,加入50%乙醇50 mL,称定重量,超声提取30 min,取出,放冷,以50%乙醇补足减失的重量,滤过,取续滤液进样,记录芫花素的峰面积,并计算药材中芫花素的含量和RSD,以考察重复性,结果表明芫花素的重复性RSD为4.42%。
2.3.9 加样回收率考察
精密称取沉香叶药材粉末(20190401,过二号筛)6份,每份约0.5 g,置具塞锥形瓶中,分别加入对照品溶液(0.352 mg/mL)1.6 mL,再加入50%乙醇48.4 mL,称定重量,超声提取30 min,取出,放冷,以50%乙醇补足减失的重量,滤过,取续滤液进样,记录芫花素的峰面积,并计算芫花素的加样回收,结果见表1。
表1 加样回收结果
2.3.10 沉香叶药材中芫花素的含量测定
精密称取不同批次的沉香叶药材粉末(过二号筛)各2份,每份约1.0 g,按供试品制备方法项下方法制备供试品溶液,采用序列进样法进样,测定供试品中芜花素峰面积,计算样品中芫花素的含量,结果见表2。
表2 不同批次沉香叶药材中芫花素的含量
根据上述测定结果,沉香叶中芫花素含量差异较大,范围在0.1516~1.0939 mg/g之间。
3 结 论
3.1 薄层色谱鉴别
分别考察了不同的展开系统,对乙酸乙酯-甲醇-乙酸(4:0.5:0.2)、二氯甲烷-甲醇-乙酸(4:0.5:0.1)、正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2),共计3种展开剂进行了考察,见图4,结果显示正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)对沉香叶药材分离效果较好,Rf值适中,故采用正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)系统作为沉香叶药材的薄层色谱鉴别的展开剂。分别对荧光显色和15%硫酸乙醇溶液显色方法进行了考察,结果显示15%硫酸乙醇显色斑点清晰,因此选择15%硫酸乙醇作为沉香叶药材薄层色谱鉴别的显色方法。
3.2 含量测定
分别对30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇进行了提取溶剂的考察,结果表明50%乙醇对沉香叶药材中芫花素的提取率最高,故确定50%乙醇为最佳提取溶剂。溶剂用量(20 mL、50 mL和100 mL)的考察结果显示,溶剂用量为50 mL时,芫花素含量最高,因此确定最佳溶剂用量为50 mL。分别对超声提取时间10 min、20 min和30 min进行了考察,结果表明超声30 min时,沉香叶药材中芫花素的含量最高,故确定超声提取时间为30 min。