沉香叶的薄层色谱鉴别及HPLC含量测定*

李锦云，柯泽涛，谢晨星，廖锦红，李永辉

(1 海南森祺制药有限公司，海南 海口 570216；2 海南医学院药学院，海南 海口 571199)

沉香为海南省常用的中草药，收载于《中华本草》[1]，沉香有抗炎、镇痛、降血糖的功效，主治便秘、肠梗阻、出血及脑缺血等症。沉香叶为白木香Aquilariasinensis.的非药用部位，主要分布于海南和广东省的低海拔山地、丘陵以及路边疏林中。其性味归经、功能主治和用法用量尚无报道。化学成分研究表明，沉香叶中含有黄酮、多酚、多糖、氨基酸类成份[2]。已有文献报道芫花素作为沉香叶的含量测定指标[3]。

现代药理学研究[4-8]表明，沉香叶在镇痛、抗炎、平喘、促进小肠推进和降血糖方面，具有同沉香药材相似的药效功效，沉香叶高剂量组(相当于沉香药材的4倍剂量)与沉香药材药效结果最相近。研究表明沉香叶安全性较好[9]，因此建立沉香叶的质量标准，对于扩大白木香的药用资源，促进沉香产业的发展具有重要的意义。

1 仪器与材料

LC-20A型液相色谱仪(包括四元泵、自动进样器、柱温箱、检测器、工作站)，日本岛津公司；SartoriusBSA124S-CW电子分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；KQ-250DB数控超声仪，昆山市超声仪器有限公司。

乙腈(色谱纯)，美国Fisher公司；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。硅胶预制板(批号17110114)，烟台化学工业研究所。芫花素对照品(纯度>98%，批号111899-201001)，中国食品药品检定研究院；10批沉香叶药材均为产地收集，由海南医学院田建平教授鉴定确定为瑞香科植物沉香属白木香Aquilariasinensis的叶。

2 方法与结果

2.1 性 状

本品多破碎，完整叶片展平后呈椭圆形或卵形，长6～12 cm，宽2～5 cm。表面黄绿色或黄褐色，微有光泽，先端渐尖，基部楔形或广楔形，边缘光滑，具短叶柄。质脆，搓之易碎。气芳香，味微苦。

2.2 薄层鉴别

2.2.1 对照药材溶液的制备

取沉香叶对照药材1 g，加甲醇50 mL，超声处理20 min，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末1 g，加甲醇50 mL，超声处理20 min，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.2.3 薄层色谱条件及结果

照薄层色谱法(通则)实验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各7 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以15%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

图1 沉香叶药材的薄层鉴别

2.3 含量测定方法的研究

2.3.1 色谱条件和系统适用性

图2 芫花素(A)和沉香叶(B)的HPLC图

优化后的的色谱条件为(岛津VP-ODS 150 mm×4.6 mm色谱柱；流动相为0.4%磷酸水-乙醇(38:62)；流速1.0 mL/min；检测波长：332 nm；柱温：40 ℃)，分别对空白溶剂(甲醇)、对照品溶液和样品溶液(批号20190401)进行进样分析，结果显示芫花素在样品中得到了较好的分离，理论塔板数为5248，分离度为7.19，溶剂对样品无干扰。

2.3.2 对照品溶液的制备

取芫花素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.022 mg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备

取本品粉末(过二号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3.5 线性关系考察

取对照品溶液(0.022 mg/mL)，采用序列进样法依次进样2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，以进样量(ng)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明芫花素在44～308 ng范围内线性关系良好，线性回归方程为Y=4388X-7673，R=0.9999。

2.3.6 精密度考察

精密称取沉香叶药材粉末(20190401，过二号筛)1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入50%乙醇50 mL，称定重量，超声提取30 min，取出，放冷，以50%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液连续进样8次，记录芫花素的峰面积，并计算RSD值以考察精密度。结果表明：芫花素峰面积的RSD为0.92%，说明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性考察

精密称取沉香叶药材粉末(20190401，过二号筛)1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入50%乙醇50 mL，称定重量，超声提取30 min，取出，放冷，以50%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液分别与0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和14 h进样，记录芫花素的峰面积，并计算RSD值以考样品稳定性。结果表明：芫花素在14 h内稳定，峰面积的RSD为2.84%。

2.3.8 重复性考察

精密称取沉香叶药材粉末(20190401，过二号筛)6份，每份约1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入50%乙醇50 mL，称定重量，超声提取30 min，取出，放冷，以50%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液进样，记录芫花素的峰面积，并计算药材中芫花素的含量和RSD，以考察重复性，结果表明芫花素的重复性RSD为4.42%。

2.3.9 加样回收率考察

精密称取沉香叶药材粉末(20190401，过二号筛)6份，每份约0.5 g，置具塞锥形瓶中，分别加入对照品溶液(0.352 mg/mL)1.6 mL，再加入50%乙醇48.4 mL，称定重量，超声提取30 min，取出，放冷，以50%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液进样，记录芫花素的峰面积，并计算芫花素的加样回收，结果见表1。

表1 加样回收结果

2.3.10 沉香叶药材中芫花素的含量测定

精密称取不同批次的沉香叶药材粉末(过二号筛)各2份，每份约1.0 g，按供试品制备方法项下方法制备供试品溶液，采用序列进样法进样，测定供试品中芜花素峰面积，计算样品中芫花素的含量，结果见表2。

表2 不同批次沉香叶药材中芫花素的含量

根据上述测定结果，沉香叶中芫花素含量差异较大，范围在0.1516～1.0939 mg/g之间。

3 结 论

3.1 薄层色谱鉴别

分别考察了不同的展开系统，对乙酸乙酯-甲醇-乙酸(4:0.5:0.2)、二氯甲烷-甲醇-乙酸(4:0.5:0.1)、正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)，共计3种展开剂进行了考察，见图4，结果显示正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)对沉香叶药材分离效果较好，Rf值适中，故采用正丁醇-乙酸-水(4:2:0.2)系统作为沉香叶药材的薄层色谱鉴别的展开剂。分别对荧光显色和15%硫酸乙醇溶液显色方法进行了考察，结果显示15%硫酸乙醇显色斑点清晰，因此选择15%硫酸乙醇作为沉香叶药材薄层色谱鉴别的显色方法。

3.2 含量测定

分别对30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇进行了提取溶剂的考察，结果表明50%乙醇对沉香叶药材中芫花素的提取率最高，故确定50%乙醇为最佳提取溶剂。溶剂用量(20 mL、50 mL和100 mL)的考察结果显示，溶剂用量为50 mL时，芫花素含量最高，因此确定最佳溶剂用量为50 mL。分别对超声提取时间10 min、20 min和30 min进行了考察，结果表明超声30 min时，沉香叶药材中芫花素的含量最高，故确定超声提取时间为30 min。