活性炭法制备高F值栉孔扇贝酶解液的工艺条件

刘海梅，王芸，裴继伟，栾钧熙，赵芹，牛丽红，张彩丽

1(鲁东大学 食品工程学院，山东 烟台，264000)2(烟台大学 生命科学学院，山东 烟台，264000)

高F值寡肽是将食物蛋白经蛋白酶降解获得的由2～9个氨基酸残基组成的F值[即支链氨基酸(branched-chain amino acid，BCAA：Val、Ile、Leu)和芳香族氨基酸(aromatic amino acid，AAA：Trp、Tyr、Phe)的摩尔数比值]>20的寡肽混合物[1-2]。此肽能满足肝病患者对蛋白质组分的特殊营养需求，辅助治疗肝性脑病，改善患者的肝功能，具有潜在的保肝、护肝作用[3-4]，以其为基料制备针对肝病患者的医用全营养配方食品已经得到了国内外研究者的广泛关注，尤其是美国、日本等发达国家已经形成相关产品，而我国尚处于研究阶段。目前，制备高F值寡肽选用的原料主要以植物性蛋白和乳源性蛋白为主[5]，基于海洋动物中蛋白质含量高的特点，以水产原料制备高F值寡肽已经成为近几年来研究的热点[6-8]，受到食品和医药界日益高度的关注。中国是世界上最大的贝类生产国，年产量1 500万t以上，占世界贝类生产总量的76%，其中栉孔扇贝(Chlamysfarreri)是我国贝类养殖的主要品种之一。如能以栉孔扇贝开发纯度高且稳定的高F值寡肽将极大地推动我国肝病患者全营养配方食品的研发与工业化进程。

制备高F值寡肽的关键技术是最大限度地脱除酶解液中的芳香族氨基酸。目前脱除芳香族氨基酸的方法主要有活性炭吸附法、膜分离法、离子交换法、凝胶过滤法等[9]，与其他方法相比，活性炭具有很高的吸附效率，对疏水性化合物的亲和力极高，BCAA和 AAA 均是疏水性氨基酸，非极性苯环侧链还与活性炭表面上的非极性吸附位相互作用。因此，当BCAA 和 AAA 同时存在时，活性炭会优先吸附AAA。而且活性炭吸附法操作简单、价格低、被广泛应用于高F值化[10]，是脱除芳香族氨基酸提高F值的有效方法[8,11-14]。活性炭对氨基酸的吸附效果受存在体系和氨基酸自身性质的影响，不同种类活性炭的吸附特性不同。不同研究对象选择的活性炭种类也不同，在从近江牡蛎、南极磷虾、带鱼等海洋资源中提取制备高F值寡肽时选用的活性炭种类不同，优化出的吸附条件也存在差异[8,12-13]。本课题组前期研究发现，栉孔扇贝中蛋白质含量占干基的52.17%，且支链氨基酸含量达193.90 mg/g，显著高于牡蛎、海湾扇贝、紫贻贝、菲律宾蛤仔，是开发高F值寡肽的优良海洋资源，但以栉孔扇贝为原料来开发高F值寡肽的研究鲜见报道。综上所述，本课题拟以去壳栉孔扇贝为原料，通过酶解工艺制备酶解液，筛选适宜脱除栉孔扇贝酶解液中芳香族氨基酸的活性炭种类，并优化活性炭脱除芳香族氨基酸制备高F值寡肽液的工艺条件，该研究将会大大提高栉孔扇贝加工的附加值，能为肝病患者全营养配方食品的开发提供优质基料，也为栉孔扇贝高F值寡肽的开发及海洋动物资源开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

栉孔扇贝，烟台渔红利水产市场；胃蛋白酶(酶活力1.5万U/g)，生工生物工程(上海)股份有限公司;风味蛋白酶(酶活力1.5万U/g)，北京索莱宝科技有限公司；活性炭A(200目)，广东舒野活性炭有限公司；活性炭B、活性炭C(200目)，河南海韵环保科技有限公司；活性炭D(200目)，天津市广成化学试剂有限公司；活性炭E(200目)，平顶山市炭诺环保材料有限公司；0.45 μm、φ10 mm微孔滤膜，上海兴亚净化材料厂。其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1300紫外可见分光光度计，上海美析仪器有限公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；pB-10普及型pH计，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；L-8900高速氨基酸分析仪，日立(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 高F值寡肽溶液制备工艺流程

工艺流程：

栉孔扇贝全肉匀浆(料液质量比1∶5)→胃蛋白酶水解(酶活力1 200 U/g，温度42 ℃，pH 3.0，反应时间9 h)→沸水浴灭酶15 min→风味蛋白酶水解(酶活力1 200 U/g，温度50 ℃，pH值为7.0，反应时间10 h)→沸水浴灭酶15 min→6 000 r/min 离心10 min→上清液→活性炭脱芳处理→0.45 μm微孔滤膜抽滤→滤液→高F值寡肽溶液

1.3.2 不同因素对活性炭脱芳效果的影响

改变某一个因素参数，固定其余因素参数，研究固液比、温度、时间和pH 4个因素对活性炭脱芳效果的影响。具体设计如下：调整固液比为1∶20(g∶g)，在pH值为7下吸附2 h，研究温度为25、30、35、40、45、50 ℃时的效果；调整温度为40 ℃，在pH值为7下吸附2 h，研究固液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g∶g)时的效果；调整固液比为1∶20(g∶g)、温度为30 ℃，在pH值为7下，研究吸附时间为5、4、3、2、1、0.5 h时的效果；调整固液比1∶20(g∶g)，温度30 ℃，吸附2 h，研究pH值为4、5、6、7、8、9时的效果。

1.3.3 芳香族氨基酸脱除效果的评价

基于支链氨基酸与芳香族氨基酸分别在220、280 nm处有最大特征吸收峰的特性，测定活性炭吸附前后酶解液在220、280 nm处的吸光值，计算两者的比值OD220/OD280、支链氨基酸保留率、芳香族氨基酸去除率[11]来判断芳香族氨基酸的脱除效果。其中支链氨基酸保留率及芳香族氨基酸去除率计算方法见公式(1)、公式(2):

支链氨基酸保留率/%

(1)

芳香族氨基酸去除率/%

(2)

1.3.4 氨基酸组成分析及F值的计算

样液用6 mol/L HCl水解24 h，调配至上机浓度，流速0.4 mL/min，进样量20 μL，检测波长570、440 nm，用氨基酸自动分析仪检测除色氨酸外的16种氨基酸的含量。色氨酸测定时，采用NaOH碱解处理样液24 h，其余操作同其他16种氨基酸的测定方法。

按公式(3)计算寡肽液的F值：

(3)

式中：MVal、MIle、MTyr、MPhe、MLeu、MTrp分别代表1 mL中含有的氨基酸微摩尔数，μmol/mL。

1.3.5 数据处理

采用Excel、SAS 8.1软件绘制曲线和方差分析，以Duncan检验法进行显著性水平分析，P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

2 结果与分析

2.1 活性炭种类的选择

活性炭制作原料的不同、颗粒大小、比表面积、孔径数目等都会引起吸附效果的不同[13,15]，颗粒状的活性炭由于比表面积小，吸附容量小，吸附效果次于粉末状的[13,16]活性炭。因此，本研究选用木质粉末状200目活性炭作为吸附材料，对比不同活性炭的吸附效果。不同种类活性炭的吸附效果如图1，经活性炭A和活性炭C吸附脱芳后寡肽液OD220/OD280值显著高于其他3种活性炭(P<0.05)。经活性炭A与C处理后，寡肽液的芳香族氨基酸去除率基本一致，而活性炭A的支链氨基酸保留率显著高于活性炭C(P<0.05)。高F值寡肽的制备需要在去除芳香族氨基酸的同时，尽量保留支链氨基酸。因此，选用活性炭A作为吸附剂。

a-OD220/OD280;b-支链氨基酸保留率和芳香氨基酸去除率(下同)图1 不同活性炭的吸附效果Fig.1 Adsorption effect of different activated carbon注：不同小写字母代表数据之间有显著性差异(P<0.05)(下同)

2.2 不同因素对活性炭吸附效果的影响

2.2.1 温度

不同温度下活性炭A的吸附效果见图2。随着温度的升高，OD220/OD280值先上升后下降；当30 ℃时OD220/OD280值最高为11.616，显著高于其他温度(P<0.05)，温度继续升高OD220/OD280值持续下降。30 ℃下芳香族氨基酸的去除率显著高于其他温度(P<0.05)，而40、45 ℃下支链氨基酸的保留率显著高于30 ℃(P<0.05)，综合OD220/OD280值、芳香族氨基酸去除率、支链氨基酸保留率3个指标，选择30 ℃作为活性炭A的吸附温度。

不同报道中活性炭的适宜脱芳温度不同，蛋清蛋白、鱿鱼高F值寡肽制备中使用的温度均为50 ℃[7,17]，牡蛎肉、南极磷虾高F值寡肽制备中的温度为25 ℃[8,12]，而金枪鱼中使用35 ℃[14]。温度的差异可能是由选用活性炭种类不同造成的，由于在相关报道中活性炭型号及规格信息不齐全无法进行比较。

图2 温度对吸附效果的影响Fig.2 The effect of temperature on adsorption effect

2.2.2 固液比

活性炭使用量关系到其在单位体积酶解液中的吸附量，因此固液比直接影响芳香族氨基酸的脱除效果。固液比对活性炭吸附效果的影响如图3。固液比对脱除效果影响显著，随着固液比的减小，即活性炭用量的减少，OD220/OD280值和芳香族氨基酸去除率先显著上升后显著下降(P<0.05)，支链氨基酸保留率一直呈显著下降趋势(P<0.05)。这种变化趋势与活性炭用量直接相关，活性炭用量越多，其吸附量越多，从而导致吸附的芳香族氨基酸量增加，但是当活性炭用量增加到一定程度后，吸附芳香族氨基酸的量达到饱和后，就会吸附更多的支链氨基酸，从而影响吸附效果。当固液比为1∶10时，OD220/OD280、芳香族氨基酸去除率和支链氨基酸保留率显著高于其他固液比(P<0.05)，分别达到24.893%、98.257%和77.287%。固液比为1∶15时的吸附效果与固液比为1∶10的吸附效果有显著性差异(P<0.05)，且比1∶10的吸附效果差。但在实际的操作中，1∶10的固液比导致活性炭使用量过多，造成抽滤困难，成本较高，所以选取固液比为1∶15。

图3 固液比对吸附效果的影响Fig.3 Effect of solid to liquid ratio on adsorption effect

2.2.3 吸附时间

不同吸附时间对活性炭吸附效果的影响如图4。吸附时间对活性炭吸附效果有显著影响(P<0.05)，吸附时间过短或过长都不利于芳香族氨基酸的去除。此变化趋势与报道一致[6,7,11-15]。吸附时间短，活性炭吸附芳香族氨基酸的结合位点未达到饱和，芳香族氨基酸吸附不完全，造成吸附效果不佳；而吸附时间过长时，活性炭吸附芳香族氨基酸达到饱和后会进一步吸附支链氨基酸，从而会造成吸附效果的下降。随着吸附时间的延长，OD220/OD280值呈先增大后减小的变化趋势，在吸附时间为2 h时 OD220/OD280值达到最大(10.603)，显著高于其他吸附时间(P<0.05)。对于支链氨基酸保留率而言，吸附时间为2、4 h时保留率显著高于其他时间(P<0.05)，且吸附2 h后，芳香族氨基酸去除率最高，显著高于其他吸附时间(P<0.05)。由此可见，活性炭吸附2 h时，芳香族氨基酸与活性炭结合位点的结合达到饱和，使活性炭吸附芳香族氨基酸的反应达到平衡[11]，再延长活性炭吸附时间会增加活性炭对支链氨基酸吸附量，导致支链氨基酸的保留率降低。所以，最优的活性炭吸附时间为2 h。

图4 吸附时间对吸附效果的影响Fig.4 Effect of adsorption time on adsorption effect

2.2.4 pH

pH的变化能显著影响吸附效果，不同pH对活性炭吸附效果的影响如图5。随着pH的增加，OD220/OD280值显著增加(P<0.05)，当pH值为7时，寡肽液的OD220/OD280达到了19.221，再增大pH值，OD220/OD280出现显著下降(P<0.05)。pH值为7时，OD220/OD280、芳香族氨基酸去除率显著高于其他pH值(P<0.05)，支链氨基酸的保留率在pH值为6时显著高于其他pH值(P<0.05)。综上分析，活性炭吸附pH值为7。

图5 pH对吸附效果的影响Fig.5 Effect of pH on adsorption

不同类型的活性炭在吸附芳香族氨基酸时适宜的pH相差较大，有在酸性pH范围的，如TX-325型粉末状活性炭的最佳pH值为2.5[12]，XHJ-800型(50目)颗粒活性炭的pH值为3[7]， 也有在中性pH范围的，如XHJ-200型(200目)粉末状活性炭pH值为6[13]，与本研究结果较接近。若活性炭脱芳所需pH过低，调节酶解液的pH需要消耗大量的酸，在产品的后期生产中还要用大量的碱进行中和保证产品质量，避免对设备造成腐蚀，产生大量的食盐，食盐的产生对产品的脱盐造成一定难度，因此，从节约成本和操作方便角度考虑，应选择适宜pH接近中性的活性炭种类。

2.3 脱芳条件的正交优化及验证

正交设计及优化结果如表1所示。根据极差分析，对OD220/OD280影响最大的因素为pH，其次为吸附时间与温度，而固液比对其影响最小；对芳香族氨基酸去除率影响从大到小排序为pH>温度>吸附时间>固液比。对OD220/OD280、支链氨基酸保留率、芳香族氨基酸去除率3个指标而言，其最优吸附条件均为吸附时间2 h、pH值6、温度35 ℃、固液比为1∶15，且在该条件下的吸附效果显著高于其他条件(P<0.05)。由此可见，上述条件即为活性炭A吸附脱芳的最优条件。

在上述优化条件下进行活性炭脱芳验证试验，脱芳后栉孔扇贝酶解液的OD220/OD280值为23.928，芳香族氨基酸去除率为93.120%，支链氨基酸保留率为73.869%，均优于正交实验中的因素组合，且F值>20，符合高F值寡肽的要求。

表1 正交优化结果Table 1 Orthogonal optimization result

2.4 高F值寡肽溶液的氨基酸组成分析

脱芳前后酶解液的氨基酸组成分析见表2。脱芳前酶解液的F值为3.91，脱芳后酶解液F值达到34.73，远高于高F值寡肽F值>20的要求。经过活性炭吸附脱芳，成功制备了高F值寡肽，且F值提高了近9倍。

表2 氨基酸组成分析 单位：μmol/mL

3 结论

以栉孔扇贝酶解液为原料，采用OD220/OD280值、支链氨基酸保留率和芳香族氨基酸去除率作为芳香族氨基酸脱除效果的3个指标，从4个厂家5种不同活性炭中筛选出适宜用于芳香族氨基酸脱除的活性炭种类为活性炭A，并探讨了温度、pH、吸附时间、固液比对该活性炭吸附芳香族氨基酸效果的影响，通过正交试验优化了吸附条件。结果表明，广东舒野活性炭有限公司生产的200目粉末活性炭吸附效果最好，最佳吸附条件为温度35 ℃、pH值6、吸附时间2 h、固液比1∶15，吸附后酶解液F值达到34.73，支链氨基酸的保留率达到73.869%，芳香族氨基酸去除率达到93.120%。经过活性炭脱芳处理的寡肽液F值符合高F值寡肽中(F值>20)的要求。本研究采用活性炭法成功制备出了栉孔扇贝高F值寡肽液，开拓了栉孔扇贝开发利用的途径，为高F值寡肽的制备提供了理论依据。