基于网络药理学探讨白花蛇舌草-半枝莲抗肝细胞癌的作用机制

浙江中医药大学 杭州 310053

原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是一种发病率极高的恶性肿瘤，病情进展快，患者5年生存率低[1]。 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是PHC最常见的病理类型，因其早期症状隐匿，大部分HCC患者确诊时已处于中晚期，已错失根治性手术的最佳时机。目前HCC的治疗方式大多为手术、化疗、放疗、分子靶向治疗等，但往往伴随严重的不良反应。因此，如何抑制HCC的发生发展，减少不良反应，延长患者生存期，已成为现今的研究热点。中医药在延缓HCC疾病进展、缓解治疗副反应、提高患者生活质量等方面优势显著[2]，日渐成为综合性治疗的重要组成部分。

中医认为，HCC可归属于“肝积”“黄疸”“肥气”等范畴，病机属正虚邪侵，为机体阴阳气血失调，痰湿热毒内生，积聚于胁下而成肿块，故治疗上当清热毒、调气血、益肝用。白花蛇舌草-半枝莲为临床常用清热解毒药对，白花蛇舌草兼有消肿止痛、半枝莲兼有活血化瘀的功效，二者相伍，共奏抗癌奇功。现代药理学研究表明，白花蛇舌草的化学成分主要包括环烯醚萜类、黄酮类、蒽醌类等化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎等多种生物活性[3]；半枝莲的主要活性成分为黄酮类、二萜及其内酯类、多糖类化合物，具有良好的抗癌、护肝及抗病毒作用[4]。研究证实，两药联合能够诱导细胞凋亡、增强免疫功能，较单药对肿瘤细胞的抑制作用更加明显[5]。然而由于中药多成分、多靶点的特性，白花蛇舌草-半枝莲药对抗HCC的具体作用机制尚未阐明。

网络药理学作为一门新兴学科，能够对中药活性成分及潜在作用靶点进行系统网络性研究，这恰好与中药多层次、多靶点、多通路的特性相符。故本研究采用网络药理学方法，挖掘白花蛇舌草-半枝莲药对的活性成分及治疗HCC的潜在靶点，并探索其作用机制，为深入研究HCC的诊治奠定基础。本研究整体框架见图1。

图1 基于网络药理学的整体研究框架Fig.1 The whole framework of the study based on network pharmacology

1 材料和方法

1.1 白花蛇舌草-半枝莲活性成分及靶点的筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/）检索白花蛇舌草、半枝莲的化学成分，同时收集其药物动力学参数，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（druglikeness，DL）≥0.18为标准[6]，筛选其有效活性成分，将收集到的药物活性成分导入到Drugbank 数据库（https://www.drugbank.ca/）中进行蛋白靶点的筛选匹配。为了提高数据的标准性及统一性，进一步运用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/），查询其蛋白靶点名所对应的人类基因名称，并匹配整理药物靶点。

1.2 HCC相关靶点的筛选 选择GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库、人类在线孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数 据 库（http：//www.omim.org/）、 治疗目标数据库（Therapeutic Target Database，TTD）（http://db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank数据库（https://www.drugbank.ca/）、肝细胞癌肿瘤数据库（Oncogenomic Database of Hepatocellular Carcinoma，OncoDB.HCC） （http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw）和Liverome数据库（http://liverome.kobic.re.kr/），以“Hepatocellular carcinoma”或“HCC”为关键词检索HCC相关靶点，整合并删除重复项。通过R语言（Version 3.6.1）将药物靶点与疾病靶点进行匹配，取交集作为白花蛇舌草-半枝莲药对治疗HCC的潜在作用靶点。

1.3 构建“药物-活性成分-靶点”网络 选用可视化软件Cytoscape（Version 3.7.1）构建“药物-活性成分-靶点”关系网络，以阐明白花蛇舌草-半枝莲药对中活性成分与疾病靶点的关系。网络下方节点代表筛选后白花蛇舌草-半枝莲药对治疗疾病的潜在作用靶点，网络上方节点代表白花蛇舌草-半枝莲药对的共活性成分，边代表白花蛇舌草-半枝莲药对与其活性成分、活性成分与潜在作用靶点、潜在作用靶点与疾病的相互关系。

1.4 构建靶点蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络 将交集后的潜在作用靶点导入String数据库（https://string-db.org/）处理，限定物种为“Homo sapiens”进行检索，构建白花蛇舌草-半枝莲药对抗HCC作用靶点的PPI网络图。

1.5 网络拓扑分析 对于网络中的每个节点，使用Cytoscape软件中的Network Analyzer工具及cytoNCA插件对其进行拓扑分析。选择3个参数来评估其拓扑特征：（1）连接度中心性（degree centrality，DC），即与一个节点直接相连的节点个数；（2）紧密度中心性（closeness centrality，CC），即从一个节点到其他节点的平均距离；（3）中介中心性（betweeness centrality，BC），即经过某个节点的最短路径数目。这3个参数在网络中起着至关重要的作用，DC越高，CC、BC越大，节点在网络中的核心地位越高。根据上述参数进行网络核心节点的筛选。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 利用R语言中Bioconductor平台及Cytoscape中Cluego插件对预测得到的关键靶点进行GO和KEGG富集分析，筛选条件为P＜0.05，Q＜0.05，分析结果以条形图、气泡图及饼状图呈现。随后用Metascape数据库（http://metascape.org/）对富集通路进行整合。

2 结果

2.1 白花蛇舌草-半枝莲药对的活性成分及作用靶点 检索TCMSP数据库得到白花蛇舌草化学成分37个，半枝莲化学成分94个；设定OB≥30%，DL≥0.18进一步筛选后，最终纳入共活性成分3个，白花蛇舌草活性成分4个（除去3个共活性成分），半枝莲活性成分26个（除去3个共活性成分）。见表1。将上述33个活性成分导入到Drugbank数据库，共收集到236个蛋白靶点。进一步查询Uniprot数据库后，得到88个白花蛇舌草、104个半枝莲对应靶点，删除87个重复项后，最终得到105个药物靶点。

2.2 HCC相关靶点 通过检索，在GeneCards、OMIM、TTD、Drugbank、OncoDB.HCC和Liverome数据库中分别获得6 592、200、47、14、325和241个HCC相关靶点，删除重复项后共筛选得到6 832个HCC相关靶点，与105个药物共同靶点匹配后，交集得到89个白花蛇舌草-半枝莲药对治疗HCC的潜在作用靶点。见图2。

2.3 “药物-活性成分-靶点”网络分析 将白花蛇舌草-半枝莲活性成分、潜在作用靶点、HCC靶点及其属性导入到Cytoscape，建立“药物-活性成分-靶点”网络。见图3。利用Network Analyzer计算节点DC，结果发现，白花蛇舌草-半枝莲药对中DC居前5位的活性成分分别为槲皮素（quercetin，degree=121）、木犀草素（luteolin，degree=28）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，degree=22）、黄芩素（baicalein，degree=19）及汉黄芩素（wogonin，degree=19）。见表2。以上成分均为白花蛇舌草-半枝莲药对治疗HCC的关键活性成分。分析网络图发现，药对中相同活性成分能同时作用于多个靶点，而相同靶点亦对应多种活性成分，证明白花蛇舌草-半枝莲药对能够多成分、多靶点发挥治疗作用。

2.4 靶点PPI网络分析 将白花蛇舌草-半枝莲药对抗HCC的89个潜在作用靶点导入String数据库平台，剔除1个无相互作用关系的蛋白后，得到由88个节点及864条边组成的PPI网络。见图4。进一步应用CytoNCA计算网络节点的拓扑参数，并进行核心靶点的筛选。DC的中位数为14，CC的中位数为0.52，BC的中位数为0.003868，基于这3个参数的中位数进行第1次筛选，即筛选条件为DC≥14，CC≥0.52，BC≥0.003868，共得到31个关键靶点。随后设定阈值为DC≥40，CC≥0.655462，BC≥0.035574进行第2次筛选，最终得到6个核心靶点，包括白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3，CASP3）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、myc基因、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）。最后构建核心靶点与白花蛇舌草-半枝莲活性成分关系网络。见图5。

表1 白花蛇舌草-半枝莲潜在活性成分Tab.1 Potential active components of Hedyotis diffusa-Scutellariae barbatae Herba

图2 白花蛇舌草-半枝莲作用靶点与HCC相关靶点交集Fig.2 Interaction of Hedyotis diffusa-Scutellariae barbatae Herba related targets and HCC related targets

图3 “药物-活性成分-靶点”网络Fig.3 “Drug-component-target” network

2.5 GO功能富集分析 通过R语言对潜在作用靶点进行分析，以P＜0.05为条件，共筛选得到1 196个GO条目，其中生物过程（biological process，BP）条目1 067个，细胞组分（cellular component，CC）条目39个，分子功能（molecular function，MF）条目90个。 结果显示，BP方面，白花蛇舌草-半枝莲药对主要参与对类固醇激素、外源刺激、氧化应激等的反应过程；CC方面，白花蛇舌草-半枝莲药对与细胞各个部分均有密切联系，包括细胞膜、细胞核、线粒体等；MF方面，白花蛇舌草-半枝莲药对主要与核受体功能、转录因子活性、近端启动子序列特异性DNA结合等功能有关。此结果证实白花蛇舌草-半枝莲药对可通过调控多种生物学途径发挥对HCC的治疗作用，进一步分析发现这些生物学途径主要与细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应和血管生成有关。以条形图展示校正后P值排名前20位的结果。见图6。

表2 DC居前5位的关键活性成分信息Tab.2 Information of key-components of DC in the top 5

2.6 KEGG通路富集分析 通过Cluego将潜在作用靶点与KEGG信号通路进行匹配，共富集得到80条信号通路，其中p53抑癌基因通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt） 通路、 缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路、VEGF通路是关键信号通路。见表3。此外，膀胱癌通路、结直肠癌通路、乳腺癌通路等也被显著富集，这表明白花蛇舌草-半枝莲药对能够通过多个信号通路发挥抗HCC及多种恶性肿瘤的作用，且其作用靶点可能为多种恶性肿瘤的共同靶标。最后，对KEGG通路富集分析行可视化处理，并在Metascape数据库中进行验证。见图7。

图4 PPI网络Fig.4 PPI network

图5 “核心靶点-关键成分”网络Fig.5 “Core targets-key components” network

3 讨论

中医认为，本虚标实为HCC之基本病机。正气先虚，加之情志过极，饮食劳倦，机体阴阳气血失衡，气滞痰凝血瘀而成癌毒。癌毒与痰瘀互结，郁久化热，更成热毒，毒热内结为HCC发生的关键病机。临床上HCC患者也常表现出发热、疼痛、口苦、烦躁、尿黄、便秘等热毒之症。《素问·至真要大论》云：“寒者热之，热者寒之……”因此对于热毒引发的恶性肿瘤，应用清热解毒的寒凉类方药治疗。作为清热解毒类方药的代表，有文献报道，白花蛇舌草联合半枝莲能够有效抑制HCC的发生发展[7]。但由于中药多成分、多靶点作用的特性，该药对治疗HCC的具体成分、靶点及机制至今尚不明确。

本研究通过网络药理学的方法探讨白花蛇舌草-半枝莲药对治疗HCC的潜在靶点及作用机制。根据网络拓扑分析结果，得到5种关键成分，6个核心靶点，结合GO功能及KEGG通路富集分析得到的5条关键通路，白花蛇舌草-半枝莲药对可能通过调节细胞增殖与凋亡、控制炎症、抗血管生成等多途径发挥治疗作用。

图6 关键靶点的GO功能富集分析Fig.6 GO function enrichment analysis for key targets

3.1 细胞增殖 细胞周期调节失控所致的细胞异常增殖，是恶性肿瘤的关键特征之一[8]。EGFR是表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）的受体，广泛分布于上皮细胞、成纤维细胞等多种细胞表面，参与细胞增殖及信号传导。EGF和EGFR的结合导致EGFR的二聚化，进一步激活PI3K-Akt通路，抑制细胞增殖[9]。myc是细胞增殖和代谢的关键调节因子，调节基因转录程序，从而影响多种人类肿瘤细胞的增殖和代谢[10]。本研究分析筛选得出，白花蛇舌草-半枝莲药对的关键靶点包括与细胞增殖相关的EGFR、myc，关键信号通路包括PI3K-Akt信号通路，说明白花蛇舌草-半枝莲药对的活性成分槲皮素及木犀草素等可能是通过抑制EGFR及myc表达，调节PI3K-Akt信号通路，从而抑制细胞增殖。且有研究证实，槲皮素可抑制EGFR及其下游信号分子PI3K、Akt的表达[11]；木犀草素可抑制Akt和PI3K的磷酸化[12]，抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，发挥抗HCC的作用，与本研究结果一致。

表3 关键KEGG信号通路信息Tab.3 Information on key KEGG signaling pathway

图7 可视化KEGG通路富集分析Fig.7 Visual analysis of KEGG pathway enrichment

3.2 细胞凋亡 研究已证实，细胞增殖与凋亡的稳态失衡是肿瘤的发病机制之一[13]。机体内凋亡信号可激活CASP表达，刺激细胞内多种信号传导通路，而CASP3是CASP家族中最重要的一种，可通过级联放大反应促细胞凋亡。HIF-1和p53信号通路为促细胞凋亡关键通路，其中HIF-1作为一种促凋亡因子，能够激活凋亡前体蛋白表达，同时p53能直接与HIF-1的氧依赖性降解结构域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD）相结合，最终诱导细胞凋亡[14]。本研究富集分析结果表明，白花蛇舌草-半枝莲药对的活性成分可能通过调节HIF-1和p53信号通路，诱导下游的CASP级联反应，从而促进肿瘤细胞凋亡。进一步分析提示，白花蛇舌草-半枝莲药对中的相关活性成分包括槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黄芩素及汉黄芩素等，以上活性成分都能通过CASP3级联反应，促进细胞凋亡。

3.3 炎症反应 肿瘤的发生发展与肿瘤微环境息息相关。炎症反应的刺激能产生多种趋化因子，从而形成炎症微环境，促进肿瘤细胞的增殖迁移。IL-6作为一种重要的炎症细胞因子，可经自分泌和旁分泌途径影响肿瘤细胞的增殖与分化。研究发现，IL-6能够介导正常成纤维细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，并促进肿瘤细胞转移[15]。NF-κB是细胞内重要的核转录因子，能够促进肿瘤中炎症基因的转录，刺激机体分泌更多的IL-6等细胞因子，起到抑制肿瘤细胞凋亡的作用[16]。本研究富集分析结果提示，白花蛇舌草-半枝莲药对中的槲皮素、木犀草素、汉黄芩素等成分可能通过降低IL-6水平，减少NF-κB表达，抑制NF-κB信号通路，从而下调下游炎症因子表达水平，控制炎症反应。此外，有研究表明癌性疼痛与某些炎性因子的表达密切相关[17]，由此进一步推测白花蛇舌草-半枝莲药对可能通过抑制IL-6、NF-κB信号通路，从而发挥抗炎作用，缓解HCC引起的癌痛。

3.4 血管生成 血管生成在肿瘤细胞的增殖和转移中发挥着重要作用，而HCC组织中存在着丰富的脉管系统。VEGFA是最重要的血管生成因子[18]，其在HCC组织中的表达明显高于正常组织[19]，VEGFA能够上调HIF-1α的表达，还可以作为一种自分泌生长因子，刺激肿瘤血管的生成[20-21]。本研究筛选发现VEGFA为白花蛇舌草-半枝莲药对的关键靶点，HIF-1及VEGF信号通路为其关键信号通路，提示白花蛇舌草-半枝莲药对可能通过作用于HIF-1α从而下调VEGFA表达水平，进一步抑制VEGF信号通路，抑制肿瘤血管生成。

综上所述，本研究基于网络药理学方法，对白花蛇舌草-半枝莲药对治疗HCC的作用进行了系统分析，明确了白花蛇舌草-半枝莲药对可能通过p53、PI3K-Akt、HIF-1、NF-κB、VEGF等信号通路发挥抗HCC作用，符合中医药多成分、多靶点、多通路的机制特点。本研究的结果为后续实验研究提供了方向。网络药理学的出现极大地推动了现代生物医药技术的发展，但仍存在数据库信息不完整、数据源算法与临床存在差异等问题，有待进一步探究。因此，积极开发智能数据库、进行深入的体内外实验探究，为临床治疗提供新的方向及依据，是中药网络药理学的发展方向之一。