基于网络药理学探讨健脾祛湿化瘀膏对支气管扩张缓解期的作用机制

秦皇岛市中医医院 河北，秦皇岛 066000

支气管扩张是一种常见的呼吸系统疾病，由于感染或阻塞引起支气管管腔充血、水肿、分泌物阻塞，导致管腔狭小、引流不畅而加重感染[1-3]，其临床表现为慢性咳嗽伴大量脓痰和（或）反复咯血[4]。本病易并发肺源性心脏病、胸膜炎、脓胸，甚至心力衰竭，且病情迁延反复，严重影响患者的生活质量，并造成沉重的经济负担[5-7]。支气管扩张可分为急性加重期及缓解期，目前西医治疗的重点集中在急性加重期，以控制感染、化痰为主[8-10]，而对于支气管扩张缓解期尚缺乏有效的治疗方案，而中医治疗在此阶段展现了巨大的优势。

支气管扩张在中医属“咳嗽”“肺痈”“肺痿”等范畴。陈实功在《外科正宗·肺痈论》中，将肺痈分为初期、成脓期、溃脓期、恢复期四期进行辨证论治[11]。现代医家治疗支气管扩张缓解期多从健脾、补肺、益肾等角度出发，兼顾祛痰逐瘀[12-14]。健脾祛湿化瘀膏由秦皇岛市中医医院研发，具有健脾益肺、祛湿化痰、活血通络的功效，临床用于支气管扩张缓解期的治疗，效果颇佳[15]。网络药理学是利用网络整体观来认识药物与机体之间相互作用的学科，本研究基于网络药理学的方法对健脾祛湿化瘀膏的有效化学成分进行筛选，探索其治疗支气管扩张缓解期的靶点基因及信号通路，进而探讨健脾祛湿化瘀膏的分子作用机制，为进一步研究中医药治疗支气管扩张缓解期的作用机制提供科学依据。

1 资料和方法

1.1 健脾祛湿化瘀膏的化学成分筛选 首先对健脾祛湿化瘀膏的中药组分进行优化，优化后方中包括白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏、冬瓜子、桃仁、藿香、防风、砂仁、太子参、芦根、薏苡仁、桔梗、莱菔子、化橘红、秦艽共17味药物。应用中药系统药理学数据库分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）对此17味中药的有效成分进行检索，根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18的标准分别对每味中药有效成分的药物动力学进行筛选。其中OB包括生物利用程度和生物利用速度，是指药物被吸收进入人体循环的程度与速度；DL反映化合物中的特定功能基团与已知药物的相似性，二者对中药化学成分活性的评估具有重要意义。

1.2 健脾祛湿化瘀膏与支气管扩张缓解期的共同靶点筛选 利用TCMSP搜索健脾祛湿化瘀膏关键化学成分的靶点信息，并通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）查询与靶点相对应的人类基因名称；再通过基因组注释数据库平台（genome annotation database platform，GeneCards）（https://www.genecards.org/）筛选出支气管扩张缓解期的疾病靶点基因，与药物靶点信息进行映射，得到药物-疾病靶点基因及与之对应的关键化学成分。

1.3 关键化学成分-靶点的网络可视化 将药物关键化学成分与药物-疾病的共同靶点基因整理成为基因列表、化合物列表、网络关系等文件，将上述文件导入Cytoscape 3.7.2软件，进行图像可视化处理，将关键化学成分与共同靶点基因之间的关系以网络图的形式予以呈现。图中节点表示关键化学成分和靶点，边表示节点之间相互作用的关系。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建 PPI网络反映蛋白间相互作用关系。将健脾祛湿化瘀膏与支气管扩张缓解期的共同靶点基因导入String数据库（https://string-db.org/Version 10.5），研究物种选择人类（Homo sapiens），将PPI评分设为0.9，并隐藏出现的游离蛋白，得到PPI网络。以不同颜色代表不同证据关系，下载PPI关系图和关系数据，筛选出前10名PPI网络核心基因。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 通过Bioconductor数据库（http://bioconductor.org/bioc Lite.R）查询药物-疾病共同靶点基因的基因ID。采用Bioconductor平台，分别设置P=0.05，P=0.05，进行GO富集分析和KEGG富集分析，输出结果并绘制柱状图，再运用Cytoscape绘图软件构建靶点-信号通路网络图。

2 结果

2.1 健脾祛湿化瘀膏化学成分的筛选 利用TCMSP对健脾祛湿化瘀膏中所含的化学成分进行检索，并通过OB≥30%，DL≥0.18的标准进行筛选，共得到165个化学成分。见表1。

2.2 药物-疾病靶点预测 通过TCMSP查询健脾祛湿化瘀膏有效成分的靶点信息，通过Uniprot进行基因ID注释。通过GeneCards和人类孟德尔遗传在线（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库搜索支气管扩张缓解期的靶点基因，输入“bronchodilator relief period”，获得评分≥5的相关疾病靶点基因共224个，将药物与疾病的靶点基因进行映射，得到药物-疾病共同靶点基因共60个。见表2。记录共同靶点所对应的健脾祛湿化瘀膏有效成分，最终得到健脾祛湿化瘀膏和支气管扩张缓解期的关键化学成分共107个。

2.3 药物关键化学成分-靶点网络构建 通过Cytoscape 3.7.2软件将药物-关键化学成分-疾病-靶点基因网络进行可视化处理。见图1。图中矩阵代表靶点，圆圈代表关键化学成分，其中不同颜色代表化合物来源于不同的药物。药物活性成分的自由度以“degree”来表示，排名前5的关键化学成分为槲皮素（quercetin，MOL000098，degree=42）、 木犀草素（luteolin，MOL000006，degree=21）、 山奈酚（kaempferol，MOL000422，degree=20）、 尼泊尔鸢尾异黄酮（irisolidone，MOL005916，degree=15）、芒柄花黄素（formononetin，MOL000392，degree=13）。 排名前10的靶点蛋白为前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、90kDa热休克蛋白αA1（heat shock protein HSP 90kDa αA1，HSP90AA1）、雌激素受体1（estrogen receptor1，ESR1）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、PTGS1、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARG）、β-2肾上腺素受体（β-2 adrenergic receptor，ADRB2）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、 孕酮受体（progesterone receptor，PGR）。

表1-1 健脾祛湿化瘀膏的有效化学成分Tab.1-1 Effective chemical components of Jianpi Qushi Huayu ointment

表1-2 健脾祛湿化瘀膏的有效化学成分Tab.1-2 Effective chemical components of Jianpi Qushi Huayu ointment

表2 药物-疾病靶点基因详细信息Tab.2 Drug-disease target gene details

2.4 PPI网络分析 将60个共同靶点基因相应的蛋白导入String数据库，研究物种选择人类（Homo sapiens），获取PPI并以评分＞0.9为标准进行筛选，绘制PPI网络图。见图2。该网络包括60个节点、166条边，通过计算每个基因连接节点的数目，找出前10个核心基因，分别为信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、 白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、转录因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、血管内皮生长因子α（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、HSP90AA1、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、MAPK14、MAPK3、STAT1、金属蛋白酶抑制剂1（metalloproteinase inhibitor 1，TIMP1），这些即为健脾祛湿化瘀膏治疗支气管扩张缓解期的核心基因。见图2、3。

2.5 GO功能富集分析 GO主要包括生物过程（biological process，BP）、 细胞组成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）三部分。 主要富集的BP包括营养水平应答（response to nutrient levels）、营养应答（response to nutrient）、氧化应激应答（response to oxidative stress）等。见图4。富集的CC包括囊泡腔（vesicle lumen）、分泌颗粒腔（secretory granule lumen）、 细胞质囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）等。见图5。富集的MF包括血红素结合（heme binding）、四吡咯结合（tetrapyrrole binding）、细胞因子活性（cytokine activity）等。 见图6。

图1 健脾祛湿化瘀膏关键化学成分-靶点网络图Fig.1 The key chemical component-target network diagram of Jianpi Qushi Huayu ointment

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析结果显示，健脾祛湿化瘀膏治疗支气管扩张缓解期的主要通路包括晚期糖基化终产物及其受体（advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、白细胞介素（interleukin-17，IL-17）信号通路、松弛素信号通路、C型凝集素受体信号通路等。见图7。

2.7 靶点-通路网络构建 应用Cytoscape软件将得到的通路和靶点信息绘制成网络图，根据连接节点数目设定degree，形状越大表示富集越显著，网络中的核心靶点为MAPK1、MAPK3、MAPK14、JUN、IL6等。见图8。

3 讨论

健脾祛湿化瘀膏由秦皇岛市中医医院研发，成分包括白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏、冬瓜子、桃仁、藿香、防风、砂仁、太子参、芦根、薏苡仁、桔梗、莱菔子、化橘红、秦艽共17味中药，其中茯苓、白术、太子参、薏苡仁益气健脾、利水渗湿，陈皮、半夏、砂仁、冬瓜子理气健脾、燥湿化痰，桃仁止咳平喘，防风胜湿，藿香化湿，化橘红理气宽中、燥湿化痰，莱菔子降气化痰、止咳平喘，秦艽祛风湿、化瘀通络，芦根清热透肺，全方共奏健脾祛湿化瘀之效。

图2 PPI网络Fig.2 PPI network

图3 PPI核心基因Fig.3 PPI core genes

图4 主要作用靶点BP条形图Fig.4 The barplot chart of BP of main targets

图5 主要作用靶点CC条形图Fig.5 The barplot chart of CC of main targets

图6 主要作用靶点MF条形图Fig.6 The barplot chart of MF of main targets

图8 靶点-通路网络Fig.8 Target-pathway network

支气管扩张是由于持续的炎症反应所造成的气道壁损害，有害的细胞因子发生级联反应，刺激免疫细胞，其所释放的蛋白酶和自由基会加重气道损伤。本研究结果显示，健脾祛湿化瘀膏所含的槲皮素、木犀草素、山奈酚、尼泊尔鸢尾异黄酮、芒柄花黄素等在与靶点基因的匹配中，具有较高的自由度。槲皮素属于黄酮类化合物，祛痰、止咳作用较强，还具有一定平喘作用，同时能够调节毛细血管张力，也可以作为抗氧化剂应用于肺部疾病的治疗中[16]。木犀草素是一种天然的黄酮类化合物，具有较强的镇咳、祛痰作用，还能够拮抗局部炎症。研究提示木犀草素能明显抑制TNF-α、IL-6等炎性细胞因子表达，影响核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的基因表达，还具有抗肺纤维化的药理作用[17]。山奈酚又名百蕊草素Ⅲ，抗菌活性良好，且能够抑制IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，从而达到抗炎效果；此外山奈酚还具有抗癌、抗动脉粥样硬化、增强胰岛素敏感性等功效[18]。有研究证实，尼泊尔鸢尾异黄酮能够明显提高耐缺氧能力，并具有较强的扩张微血管、降低血管阻力的作用[19]。芒柄花黄素对机体损伤具有保护作用，能够调节炎症反应，帮助机体清除代谢废物，并能调节机体的免疫功能[20]。以上几种化学成分均具有减轻炎症反应、增强机体免疫力、调节血管阻力的作用，有助于拮抗支气管扩张的炎症反应，同时能够调节机体免疫力，减轻气道的损伤。

本研究中的关键靶点蛋白有PTGS2、HSP90AA1、ESR1、AR、PTGS1、NOS2、PPARG、ADRB2、MAPK14、PGR等。PTGS2可将花生四烯酸酯转化为前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2），上述过程是前列腺素合成的重要步骤，能够产生炎性前列腺素，其上调与细胞粘附增加、表型改变和肿瘤血管生成有关[21]。HSP90AA1是一种分子伴侣，能够促进特定靶蛋白的成熟和结构维持，并具有对细胞周期和信号转导的调节作用。ESR1参与真核基因表达的调节，并能影响靶组织中的细胞增殖和分化。AR是一种类固醇激素受体，为配体激活的转录因子，可调节真核基因表达，并影响靶组织中的细胞增殖和分化。PTGS1参与类前列腺素的组成型生产，尤其是在胃和血小板中，该过程是前列腺素产生的关键步骤，在细胞保护中起着重要作用。NOS2可合成一氧化氮（nitric oxide，NO），后者是具有多种功能的信使分子，NOS2还具有亚硝化酶活性，并能介导细胞质靶蛋白的半胱氨酸S-亚硝基化[22]。PPARG能控制脂肪酸的过氧化物酶体β-氧化途径，是脂肪细胞分化和葡萄糖稳态的关键调节剂。ADRB2属于G蛋白偶联受体1家族，可通过G蛋白的作用介导儿茶酚胺诱导的腺苷酸环化酶激活[23]。MAPK14是MAPK信号转导途径的重要组成部分，在细胞反应级联中起着重要作用[24]。PGR参与真核基因表达的调节，并影响靶组织中的细胞增殖和分化。

本研究富集的信号通路有AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等。AGE-RAGE信号通路在促炎症反应中起到非常重要的作用，其中RAGE在炎症反应中作为促炎性介质[25]；TNF具有抑制细胞增殖的作用，同时能够抗感染、抑制病毒复制及病毒蛋白合成[26]；IL-17诱导的转录因子能够抑制炎症基因的表达，IL-17信号通路则与自身免疫性疾病及癌症的发病密切相关[27]。可见健脾祛湿化瘀膏可能通过抗感染、抗炎、调节免疫力等多种途径对支气管扩张缓解期起到治疗作用。

综上所述，本研究探索出健脾祛湿化瘀膏治疗支气管扩张缓解期的关键化学成分、作用靶点及作用信号通路，并对健脾祛湿化瘀膏治疗支气管扩张缓解期多成分、多靶点、多通路的复杂作用机制进行了探讨，为未来更广泛的临床应用提供了理论支撑。但网络药理学目前存在数据库不完善、对药材成分认识存在差异的问题，故在药物的认识研究、新药预测方面仍存在着局限性，需要更深层次的研究加以佐证。