实时荧光定量PCR 技术在畜禽肉类检测中的应用

□ 夏 澜 嵊州市食品药品检验检测中心

肉类是人类获取蛋白质的主要来源之一，其中的营养物质是维持人类生命活动所必需的。从蛋白质水平和核酸水平上对肉类成分进行分析已经成为解决肉类掺假问题的主要手段。在蛋白水平上，常常通过液相色谱、ELISA（酶联免疫吸附反应）以及高效液相色谱等对样品的成分进行分析。但这类方法在检测加工样品时的特异性、准确性较差，且对检测样品的处理和仪器的要求较高。在核酸水平上进行检测时，由于DNA 的稳定性和特异性可以较为准确的对待测样品的成分进行分析。目前这类检测方法中的DNA探针杂交、普通PCR、限制性片段长度多态性扩增以及荧光定量PCR 在肉类来源的检测中应用的较多[1—4]。

1 荧光定量PCR 技术的检测原理

聚合酶链式反应（PCR）最早是KaryMullis 在分析疾病基因时发明的[5]。而荧光定量PCR 技术是在普通PCR 的基础上，将能够发出荧光信号的探针或染料与引物一起加入到反应体系中，根据碱基互补配对原则进行半保留复制，通过对荧光信号的收集达到实时监控PCR 过程的目的[6]。该方法在封闭的体系中进行扩增和实时监测，无需电泳就能得出结果，且在一定程度上避免了检测样品之间的交叉污染。同时，荧光定量PCR 的模板序列较短，可以缩短检测时间，快速得到检测结果。而根据产生荧光信号方式的不同，荧光定量PCR 技术可分为Taq Man 探针法和SYBR Green I 荧光染料法。

2 荧光定量PCR 技术在肉制品检测过程中的应用

使用实时荧光定量PCR 技术对肉制品肉源的检测主要是检测动物细胞中线粒体相关基因。众所周知，线粒体DNA 是细胞质遗传的，具有含量多、分裂快等优点，同时不同组织部位中线粒体DNA 的含量具有很大的差异。因此对肉制品中肉种类以及数量的检测通常选用线粒体基因。此外，相比较核基因，线粒体基因的检测具有较高的灵敏度和稳定性。常用作检测肉类来源的线粒体基因主要是细胞色素b 基因、细胞色素c 氧化酶亚基基因和线粒体D—loop 区域的基因[4，7]。

2.1 TaqMan 探针实时荧光定量PCR 技术

肉制品的鉴定主要依靠蛋白质检测和基因检测这两种方法，相比较基因，蛋白质在食品的加工过程中易受到高温、高压等加工条件的影响，而脱氧核糖核酸具有更好的热稳定性。另一方面，食品中动物性成分的DNA序列的保守性更强，且其在提取过程中基本不受外界环境以及加工过程的影响。在混杂着牛肉、鸡肉以及猪肉的混合肉类中，使用TaqMan 探针能够有效检测到猪肉成分，且最低的极限为0.1 pg。除了单一食品的检测，在掺杂其他原料的混合肉制品检测过程中，这种方法也具有较强的检测效率。研究人员对市场上销售的包括牛肉干、火腿、香肠在内的22 种常见的肉类加工产品进行检测，发现这些肉制品中均能够检测到猪肉特异基因的荧光信号，这表明这些肉类商品中均含有猪肉的成分，可能存在掺假。同一种肉制品不同批次的检测结果也存在着较大的差异，这可能是由于不同组织肉中核酸的提取量不同[3—4]。

2.2 荧光染料实时荧光定量PCR技术

与设计引物探针相比，DNA 复制过程中荧光染料嵌入到DNA 分子中具有更强的优势。使用SYBR Green I 染料对市场上售卖的猪肉样品的最低检测极限在0.1 ng 左右。相似的结果也被其他的研究人员发现，如使用Eva Green 染料对加工肉制品中是否存在猪肉进行分析，检测结果显示这种方法也能够准确检测出生肉制品和熟肉制品中猪肉的含量。除了对检测样品中掺杂的肉类进行定量的检测外，该方法还能进行定性检测。如研究人员使用荧光染料对市售牛肉中是否含有马肉进行定量和定性的分析，结果显示使用荧光染料能够检测到的最低值为0.1 pg。这些结果表明荧光染料荧光定量PCR 技术在定量和定性检测肉类来源方面发挥重要作用[4，8—9]。

3 展望

虽然荧光定量PCR 技术在肉制品种类以及食品安全检测方面有着不可替代的优势，但该技术目前在应用上仍然存在一些问题。如肉制品的加工过程可能会导致DNA 链的断裂，并在扩增过程中产生交叉污染，荧光探针或染料的价格较高等都会影响其应用及检测效果。因此，应进一步研究荧光定量PCR 技术与其他技术的结合，将其更好地应用到肉制品的检测工作中。