市售高盐稀态酱油中氨基甲酸乙酯含量的调查分析

王军喜，何一龙，刘晓艳*，白卫东，钱敏，赵文红

1. 广东粤师傅调味食品有限公司（开平 529341）；2. 仲恺农业工程学院轻工食品学院（广州 510225）

氨基甲酸乙酯（EC），又名尿烷。20世纪70年代，由外国学者在发酵食品中首次发现[1]，是食品在发酵和储藏过程中产生的天然副产物，广泛存在于传统发酵食品中（包括面包、酸牛奶、葡萄酒、豆豉、黄酒、酿造酱油和食醋等）[2-3]。EC于2007年被世界卫生组织（WHO）认定为“2A”级致癌物[4]。EC具有口服毒性，但急性低，麻醉小型啮齿类动物的单次剂量需达到1 000 mg/kg mb以上；研究发现，长期摄入EC会导致试验小鼠体质量和存活率下降及肿瘤的发生。人体摄入EC质量浓度超过30 μg/L后，患癌概率增加，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病[5-6]。

酱油作为一种区域性强的发酵型调味品，在亚洲国家生产和食用量较大。酱油中的精氨酸、瓜氨酸含量非常丰富，且在发酵过程中会有一定浓度的尿素及乙醇产生。EC可由尿素、瓜氨酸和乙醇自发反应生成[7-8]。有学者研究发现，在葡萄酒酿造的酒精发酵后期，精氨酸代谢产生的瓜氨酸、尿素等物质会与乙醇发生缓慢的化学反应生成EC，但以尿素为主[9]。在黄酒的研究中同样认为EC是乙醇与尿素反应生成为主[10]。酱油中EC的主要前体物质被认为与瓜氨酸关系较大[11]。酱油的酿造时间长，也为EC的形成提供了条件。然而，目前我国尚未制定发酵食品和酒精饮料中EC的限量标准，也未引起足够重视。在非酒类食品中，酱油中EC含量要显著高于其他食品[12-13]，国内对于酱油中EC的研究较少，且安全问题未进行合理评估。随着酱油消费量日渐增加，分析我国酱油中EC含量水平，评估广东传统酿造酱油中EC的现状势在必行。试验利用固相微萃取-气质联用（SPE-GC/MS）法对市售35种广式传统酿造高盐稀态酱油中的EC进行调查分析，试验结果为酱油的安全生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱油样品（市售）。

EC标准品（纯度＞99%，美国Sigma公司）；氨基甲酸乙酯标准品、D5-氨基甲酸乙酯（nPC，纯度≥98.5%，德国Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇（色谱纯）、二氯甲烷（分析纯）：广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

GC-MS（6890-5973i，美国安捷伦公司）；INNONWAX毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μ m，美国安捷伦公司）；旋转蒸发仪（RE-52c，巩义市予华仪器公司）；氮吹仪（MD200-1，江苏盛蓝仪器制造有限公司）；恒温磁力搅拌器（78HW-1，金坛市国旺实验仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

参照GB 5009.223—2014方法稍有改动。准确称取2 g酱油样品于10 mL具塞试管中，加入100 μL 2 μg/mL的D5-氨基甲酸乙酯溶液，超声使其溶解，混匀后真空条件下将样液缓缓倒入碱性硅藻土固相萃取小柱并静置10 min。经适量正己烷淋洗后，用适量5%乙酸乙酯-乙醚溶液以流速1 mL/min进行洗脱，洗脱液经装有适量无水硫酸钠的漏斗脱水后，收集到10 mL刻度试管中，室温下氮气吹至约0.5 mL，用甲醇定容至1.00 mL，上机检测。

1.3.2 GC-MS色谱条件

色谱柱：HP-INNOWAX 30 m×0.25 mm（内径）×0.2 μm（膜厚）；进样口温度220 ℃；SIM模式扫描；进样量1 μL；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；流速1.2 mL/min；不分流；升温程序：初始温度50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。

1.3.3 标准曲线的绘制

结合唐双双等[14]和崔海灏等[15]的方法，稍作改动。准确称取氨基甲酸乙酯标准品，用甲醇定容至0.5 μg/mL，同样方法称取D5-氨基甲酸乙酯（D5-Ethyl carbamate）标准品，甲醇定容至2 μg/mL；分别准确吸取氨基甲酸乙酯标准溶液（0.5 μ g/mL）于容量瓶中定容，得到质量浓度为10，25，50，100和200 ng/mL的标准中间液，准确吸取100 μL 2 μg/mL D5-氨基甲酸乙酯标准液，分别加入到各浓度标准中间液，得到标准工作液，现配现用。

1.3.4 结果分析

数据均使用SPSS Statistic 17.0软件进行分析，采用Origin 8.6软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 EC的检测方法

以固相萃取法萃取酱油中EC，参考文献发现EC蒸汽压较高，易升华，外标法定量回收率低，目标物损失较大，故试验采用内标法定量检测，以D5-氨基甲酸乙酯作为内标物，用GC-MS定量分析[16]。以离子色谱峰面积与其对应浓度作线性回归，得到标准曲线y=1.305 063x+0.025 213（R2=0.999 4），线性结果较好。

2.2 酱油中EC的含量调查

从广州各市区随机购得35个酱油样品，均为广东本地品牌且被生产企业标注为酿造酱油，所用的工艺均为高盐稀态工艺（GB/T 18186）。

检测35个市售高盐稀态酱油样品中氨基甲酸乙酯含量，结果如表1所示。被调查样品来自7个不同品牌，Z牌、W牌、R牌、L牌、H牌、D牌和C牌分别占样品总数的20.0%，14.3%，11.4%，14.3%，28.6%，2.9%和8.8%。其中特级、一级、二级和三级酱油（氨基酸态氮不低于0.8，0.7，0.55和0.4 g/mL）分别占全部样品的40%，17.1%，14.3%和28.6%。在调查样品中均有检出EC，其范围为2.9～104.2 μg/kg，平均值为16.9 μg/kg，中位值为11.2 μg/kg；与王立媛等[17]调查浙江市售酱油中EC含量1.6～80.8 μg/kg有所差异；试验调查样品主要集中在广州市售高盐稀态酱油，由于地域差异，酱油的酿晒工艺存在不同，导致两地酱油中EC含量也存在差异，EC含量略高于浙江。

表1 市售酱油中EC含量的调查

2.3 酱油中EC含量的统计分析

2.3.1 不同品牌酱油中EC含量次数分布统计分析

不同品牌酱油中EC的统计结果，详见表2和表3。EC含量高于100 μg/kg有1个，占2.9%；EC含量在50～100 μg/kg之间的有2个，占5.7%；EC含量在20～50 μg/kg之间有3个，占8.6%；EC含量在10～20 μg/kg之间有13个，占37.1%；EC含量在10 μg/L以下的16个，占45.7%。被调查酱油中EC含量主要在0～20 μg/kg之间，占总样品的82.9%，结果表明广州市售酱油大部分安全。在7个品牌中，EC含量平均值最大的为C品牌，达到41.2 μg/kg，其次是H品牌（23.3 μg/kg）；平均值最小的为R牌（7.0 μg/kg）；EC含量中间值最大的是H牌，为16.0 μg/kg，最小的为R牌（5.5 μg/kg）；EC含量最大值最高的是C牌（104.2 μg/kg），其次是H牌（72.8 μg/kg）；R牌最小值为2.9 μg/kg，是所有品牌中最小值最小的。

表2 酱油中氨基甲酸乙酯含量的次数分布表（n=35）

表3 不同厂家酱油中EC含量描述性统计结果

2.3.2 不同等级酱油中EC含量的统计分析

由图1可以看出，一级酱油中EC含量主要在0～10 μg/kg之间；二级、三级主要在0～20 μg/kg之间；特级酱油各区间均含有EC检出（0～10，10～20，20～50及50 μg/kg分别占11.4%，14.3%，5.7%和8.6%）；不同等级酱油中EC含量差异较大，部分特级酱油中EC含量偏高，但总体明显高于其他等级的酱油；这可能与特级酱油中氨基酸态氮含量高于一级、二级和三级有关，氨基酸态氮含量越高，酱油中游离氨基酸越多，前体物精氨酸、瓜氨酸含量越高，EC更容易形成。二级、三级酱油经过二次三次淋油，其具有更多时间进行乙醇发酵和尿素生成，所以二级、三级酱油中EC含量略高于一级酱油。

图1 不同等级酱油中氨基甲酸乙酯（EC）含量对比

3 结论与讨论

通过SPE-GC/MS法对广东35个酱油样品中EC含量进行检测调查，结果表明，EC含量高于100 μg/kg有1个，在50～100 μg/kg之间有2个，在20～50 μg/kg之间有3个，在10～20 μg/kg之间有13个，在10 μg/L以下有16个，分别占总数的2.9%，5.7%，8.6%，37.1%和45.7%；EC含量主要在0～20 μg/kg之间，占总样品的82.9%，说明广州市售酱油大部分是安全的。但EC含量高于20 μg/kg的占17.1%，且有一个样品的EC含量高于100 μg/kg，酱油中的EC问题也不容忽视。特级酱油中EC含量明显高于其它等级，各品牌EC含量差异明显，这可能与其酿造工艺有关；酿造酱油都要经过选料、蒸煮、制曲、酿晒、灭菌、沉淀、调味等加工工序[18]，除选料、蒸煮和沉淀以外，制曲、酿晒、灭菌工艺根据各自特色有所差异；不同品牌、发酵时间、灭菌工艺及调配工艺不同会导致产品EC含量不同。