麻城老米酒中有机酸物质的初探

王奕芳，陈茂彬，张玉，李琴，方尚玲

1. 湖北工业大学生物工程与食品学院（武汉 430068）；2. 湖北省酿造工艺与装备工程技术中心（武汉 430068）

麻城酿造老米酒有千年的历史，主要产于麻城市东部地区的木子店、东古城等地。由糯米和特殊的金银花酒曲制成，色泽清亮，味道淳甜，含有丰富的营养成分和功能成分[1]，因而深受人民群众欢迎。麻城老米酒属于黄酒的一种，与黄酒相同的也含有有机酸和γ-氨基丁酸。

“无酸不成酒”，酸既能有效降低酒的甜度，又可以有效增加酒的浓厚感，并且酸还是酒产香味的前体物质[2-4]。酒中含有多种有机酸，包括挥发性酸和非挥发性酸。乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等有机酸，属于挥发性酸，它们的相对分子质量越小，刺激性越强，适量的挥发性酸可以有效帮助酒的香气形成，超过一定量则可能会导致酒的口感偏酸；乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸等属于不挥发性酸，它们能增加酒的醇厚感[5-7]。适量的酸可以在酒中起到调节和缓冲诸味的作用，但是酸度过高或过低，将会导致酒的品质下降[8]。由此可见，有机酸的含量作为酒中重要的呈味物质，对酒的口感滋味和品质也有着较大的影响，因而进一步明确麻城老米酒中有机酸的种类及有机酸含量也是极为必要的[9-10]。此外，有机酸对于改善胃肠道的消化功能、抗疲劳等保健功能等方面也具有重要的意义。比如苹果酸具有抗疲劳、保护肝脏和增强心脏功能的作用，而柠檬酸和乙酸则具有抗老化、抗疲劳和降低血压等作用[11]。目前，用于测量有机酸的方法有红外光谱法、酸碱滴定法、分光光度法、毛细管电泳法、反相高效液相色谱法、气相色谱法和离子色谱法等。然而，这些方法前处理都很繁琐，而且能达到同时分离的有机酸种类较少[12]，而高效液相色谱法（HPLC）具有灵敏度高、分辨率高、重现性好、测定准确和快速等优点[2,8]。

试验以糯米为原料，经半固态发酵酿造获得富含多种活性成分的麻城老米酒，采用高效液相色谱法（HPLC）全面着重分析麻城老米酒中的有机酸含量，旨在了解麻城老米酒中主要成分的含量，为麻城老米酒工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麻城老米酒：麻城市某酒厂生产的3种不同类型的酒，分别为c1（在米曲中添加酵母K）、c2（在米曲中添加酵母cxds）、c3（在米曲中添加酵母S）。

草酸、酒石酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、磷酸二氢钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；丙酮酸：阿拉丁试剂公司；L-苹果酸：上海麦克林生化科技有限公司；甲醇（均为色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000高效液相色谱仪及检测器：美国Thermo Scientific公司；Sino Chrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm）：大连依利特分析仪器有限公司；DTD-3R超声波清洗仪：湖北鼎泰精锐仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 麻城老米酒酿造工艺

糯米→选料→浸泡→滤水→水洗→蒸饭→摊凉→拌曲、加水→装缸→发酵→压榨→澄清→灭菌→成品

1.3.2 操作要点

选料：选取颗粒饱满、无杂质、无霉变的糯米。

浸泡：秋季浸米的时长8～10 h，浸米水温20～25℃，冬季浸米的时长12～15 h，浸米水温10～15 ℃。

滤水、水洗：把浸米的水滤掉之后，再用清水清洗2～3遍即可。

蒸饭：蒸米以蒸汽冒出时开始计时，出蒸汽15～20 min，蒸出的米要求米粒松、软、透、不粘连。

摊凉：是在洁净卫生竹制凉席上自然降温，冷却至20～30 ℃。

拌曲、加水、装缸：先在缸内撒一层曲，然后一层米一层曲，直到把原料放完（1缸是50 kg米），最后倒入水，再撒入剩余的曲，封缸发酵（发酵中途不能开缸）。

发酵：在20 ℃左右的情况下，发酵1个月。

压榨、澄清：经30 d发酵，酒液开始澄清，说明发酵基本结束，此时可以开坛取酒，把酒装入压榨机进行压榨，让酒糟分离。压榨出来的酒通过沉淀后，装入酒瓶中。

灭菌：75 ℃灭菌15～20 min。

1.3.3 流动相的配制

称取6.800 0 g KH2PO4，用超纯水溶解KH2PO4定容至1 000 mL，得到浓度为0.05 mol/L的磷酸二氢钾，用磷酸调pH至2.90。

1.3.4 标准溶液的配制

分别称取草酸、酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酮酸各0.03，0.30，0.12，0.40，0.55，0.45，0.50和1.00 g，用浓度为0.05 mol/L的磷酸二氢钾溶解于25 mL的容量瓶中定容，制成混合酸标准样品液。将上述标准样品液用磷酸二氢钾稀释5，10，25，50和100倍，并分别进样分析作标准曲线。

1.3.5 样品前处理方法

取少量酒样分装在离心管中，在10 000 r/min条件下离心20 min，再通过0.22 μm过滤膜过滤后，直接进样。

1.3.6 色谱条件

色谱柱为Sino Chrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为甲醇，流动相B为0.05 mol/L的磷酸二氢钾，并使用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。流速0.8 mL/min，紫外检测波长210 nm，进样量20 μL。

表1 梯度洗脱程序

1.3.7 定性定量方法

定性：在选定的色谱条件下，确定每种物质的保留时间。

定量：将标准溶液浓度稀释成一系列浓度后，在选定的色谱条件下，以对照的标准品溶液的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到回归方程。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

在波长210 nm附近许多缓冲溶液具有强吸收，因此增加了本底值，灵敏度下降，有时根本不能进行测定。磷酸盐缓冲溶液是最典型、适用的洗脱液，在紫外区域几乎没有明显的吸收，可以利用它作为流动相来测定有机酸[13-15]。磷酸盐缓冲溶液浓度的高低直接影响其缓冲容量的大小及缓冲溶液的离子强度，从而直接影响色谱柱的分离效果。磷酸盐缓冲溶液的浓度越高，酸的存在形式越稳定，但缓冲溶液的浓度不能太高，因为其溶液浓度增高时，离子强度也会增大，这样不利于组分的分离，同时也影响柱子的使用寿命，增加了流动相的本底吸收，降低了测定的灵敏度。参考文献[10]，选择浓度为0.05 mol/L的磷酸二氢钾为流动相水相。

当不加有机相时，草酸、酒石酸和柠檬酸不能很好分离；当加入甲醇后，8种有机酸能很好地分离，所以选择加有机相。

2.2 流动相流速确定

分别选择流动相流速0.50，0.70，0.80和1.0 mL/min作试验，发现0.5～0.8 mL/min范围内分离效果相差不大。流速越低，分析时间就越长，柱效也会变得越差，因此，确定流速为0.8 mL/min。

2.3 色谱条件的确定

从上述试验中，最终确定分离有机酸的色谱条件是检测波长210 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL，甲醇与0.05 mol/L的磷酸二氢钾梯度洗脱（表1）。在该色谱条件下进样，得到标准样品中8种有机酸的分离色图谱和保留时间。

由图1可见，8种有机酸得到了很好分离。在13 min之内，8种物质就能得到分离，且洗脱程序不复杂，分离效果良好。

由图1和图2可以看出，图1各标准样品的峰型没有图2的峰型好看，且图1的分离效果也没有图2的好，说明用流动相1∶1稀释样品得出的峰分离效果更佳。

2.4 标准曲线、检出限

采用以上确定的色谱条件，得到以下8种有机酸的回归方程，由表2可知，相关系数R均大于0.999 0，说明线性关系良好。各组分目标物的检出限为0.072～0.104 mg/L，满足不同种类物质的检测要求。

图1 有机酸混合标准样品色谱图（不加甲醇）

图2 有机酸混合标准样品色谱图

表2 8种有机酸回归方程及检出限

2.5 老米酒中有机酸物质分析

按照1.3.5方法对老米酒样品c1、c2、c3处理，对处理过的样品进行高效液相色谱分析，样品中有机酸含量见表3。

由表3可知，3种不同类型的老米酒中含有丰富的有机酸，其中c1老米酒中含量最高的是乙酸，其次是乳酸、琥珀酸以及丙酮酸；c2老米酒中含量最高的是乳酸，其次是琥珀酸、乙酸以及柠檬酸；c3老米酒中含量最高的是乳酸，其次是琥珀酸、乙酸以及柠檬酸。从测定的这8种有机酸来看，乳酸、乙酸、琥珀酸是这3种老米酒中主要有机酸组成成分，占总含量的比例较大。而这3种酸在麻城老米酒发酵过程中扮演重要的角色，乙酸属于挥发性酸，是导致酒有醇厚感的主要物质；乳酸、琥珀酸属于非挥发性酸，是使酒具有回味感的主要物质[16-17]。同时，它们还赋予酒独特的风味。乳酸赋予酒的风味是稍有涩感、尖利酸味；乙酸赋予酒的风味是温和、爽快酸味、有新鲜感，后苦短；琥珀酸赋予酒的风味是酸、咸、苦复合味[18-19]。由此可见，这3种有机酸作为麻城老米酒有机酸重要组成部分，增添了麻城老米酒风味的独特性。而3种不同类型老米酒8种有机酸总量与绍兴黄酒相比，含量相对较低，与米酒相比，含量稍高。这可能是由于绍兴黄酒中的有机酸物质主要来源于原料（大米、小麦）的转化，特别是由于发酵周期长（传统工艺酒达100 d左右），小麦带皮发酵，麦皮中的大量物质可以直接融入到酒中。老米酒发酵时长比绍兴黄酒短，而比米酒长，另外，绍兴黄酒一般用的酒曲是麦曲，而老米酒用的甜酒曲，这些原因都会导致有机酸物质含量的不同。

表3 样品有机酸含量的测定

3 结论

在选定的色谱条件下，首次采用高效液相测定麻城老米酒中的8种有机酸物质，并且在13 min之内使这8种物质得到了较好的分离，8种有机酸物质的回收率在95.6%～101.5%之间，其相对偏差在0.08%～0.25%之间，说明此测定方法准确可靠。

由以上试验可知，麻城老米酒中含有一定量的有机酸物质。3种不同类型的老米酒中含有丰富的有机酸，其中c1老米酒中含量最高的是乙酸，其次是乳酸、琥珀酸以及丙酮酸，c2老米酒中含量最高的是乳酸，其次是琥珀酸、乙酸以及柠檬酸，c3老米酒中含量最高的是乳酸，其次是琥珀酸、乙酸以及柠檬酸。从测定的这8种有机酸来看，乳酸、乙酸、琥珀酸是这3种老米酒中主要的有机酸物质，占总含量的比例较大。通过其测定结果与绍兴黄酒、米酒中有机酸物质含量的对比，结果发现麻城老米酒中有机酸物质的含量与其工艺密切相关，为老米酒类产品的开发和保健功能的研究提供依据。

此次试验只对麻城老米酒中的有机酸进行了检测，而麻城老米酒中不仅仅只含有了有机酸，还含有其他的功能成分，比如氨基酸、维生素等，有待进一步的研究。