虾青素对脑出血大鼠的神经保护作用及对Toll样受体4/核因子κB介导的神经炎症反应的影响▲

涂 婷 郑晓梅 左清娇 周子薇 先 耀

(西南医科大学附属医院神经内科，四川省泸州市 646000，电子邮箱：1054328488@qq.com)

脑卒中已成为威胁全球居民生命健康的重大疾病[1]，其中出血性脑卒中具有发病率高、死亡率高以及致残率高的特点，严重危害患者的生命健康和生活质量。研究表明，血肿周围的脑组织在脑出血早期就已出现炎症细胞和炎症因子的浸润，而这加重脑水肿[2]，因此，减轻炎症反应是缓解脑出血后继发性脑损伤的关键。脑出血后，血肿成分通过激活小胶质细胞触发炎症通路，而主要在小胶质细胞中表达的Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)作为一种模式识别受体，在免疫识别、炎症调节等各个方面扮演着重要的角色[3]，其被激活后可以通过调控核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)信号通路促使大量的促炎细胞因子生成并释放，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-1β等，从而引起强烈的炎症反应[4]，因此抑制TLR4信号通路的激活有利于控制炎症反应。天然虾青素是一种类胡萝卜素类植物化学物，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、免疫增强等作用[5]。此外，虾青素可有效通过血脑屏障，直接作用于中枢神经系统[6]，故近年来虾青素的神经保护作用受到广泛关注。本研究分析虾青素对脑出血大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表达的影响，探究虾青素的脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无病原体级的SD雄性大鼠80只，体质量(250±10)g，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证编号:SCXK(川)2015-030。均饲养于西南医科大学动物房，用标准饲料喂养，饮用自来水，自然光照，平均室温(25±2)℃。

1.2 主要试剂 虾青素(索莱宝科技有限公司，批号:SA8730)、TLR4抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，批号：ab22048)、NF-κB抗体(美国CST公司，批号：ab16502)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(英国Abcam公司，批号：ab37168)、酶联免疫吸附测定法试剂盒(南京奥青生物技术有限公司，TNF-α批号：ANG-E11043R-1；IL-1β批号：ANG-E14252G)、辣根过氧化物标记的山羊抗兔二抗(武汉ASPEN公司，批号：AS1107)、二喹啉甲酸蛋白质浓度测定试剂盒(武汉ASPEN公司，批号：AS1086)、RIPA裂解液(武汉ASPEN公司，批号：AS1004)、显影定影液(武汉ASPEN公司，批号：AS1027)、光学显微镜(日本Olympus 公司，型号:CX-21)、冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号:TGL-16)。

1.3 实验方法

1.3.1 脑出血模型的建立与分组干预：(1)分组。按随机数字法将大鼠分为假手术组、脑出血组、虾青素低剂量组、虾青素高剂量组，每组20只。(2)建模。参照文献[7]采用自体血注入法建立大鼠脑出血模型。大鼠称重后，给予3%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位固定于脑立体定位仪上，定位右侧尾状核(以前囟为中心，向后 0.2 mm，右侧旁开3 mm，深6 mm)，钻孔。除假手术组外，其余3组大鼠断尾取血，采用经典的“改良二次注血法”注血，第1次匀速注血20 μL(耗时2 min,留针7 min)，第2次以同样速度注血30 μL(耗时4 min,留针10 min)，缓慢拔针、缝合、消毒，并对大鼠做好标记。假手术组经颅骨钻孔后注入等体积生理盐水。(3)干预。造模3 h后，参照文献[8]分别给予虾青素低剂量组和虾青素高剂量组大鼠20 mg/kg、80 mg/kg的虾青素灌胃(虾青素采用花生油稀释成1 mg/mL)，假手术组和脑出血组给予等量花生油灌胃，均1次/d，连续3 d。最后一次灌胃后进行相关指标检测，每项指标各组均随机取5只大鼠进行相关标本采集。

1.3.2 神经功能缺损评估及脑组织含水量的测定：随机取5只大鼠按Garcia评分[9]标准对大鼠进行神经功能评分，分数越低，说明神经功能障碍越重。过量麻醉(10%水合氯醛，剂量为0.35 mL/100 g)处死5只大鼠，断头取脑，称量湿重，在90℃烤箱烘烤至恒重，称量干重，计算脑组织含水量,脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3.3 酶联免疫吸附测定法检测TNF-α和IL-1β的含量：过量麻醉(1%水合氯醛，剂量为0.35 mL/100 g)处死5只大鼠，断头取脑，取血肿周围(0.2～0.3 cm)脑组织，加入RIPA裂解液(每100 mg组织中加入1 mL RIPA裂解液)匀浆，1 000 r/min离心15 min，留取上清液，严格按试剂盒说明书进行操作，检测TNF-α和IL-1β的含量。

1.3.4 免疫组织化学法检测TLR4 和 NF-κB蛋白的表达：过量麻醉(1%水合氯醛，剂量为0.35 mL/100 g)处死5只大鼠，断头取脑，取血肿周围脑组织用4%多聚甲醛固定后，用石蜡包埋，连续切片，厚度4 μm。置于载玻片上，4 ℃保存。将备用切片参照试剂盒说明书进行操作。于Olympus光学显微镜下观察，胞浆或胞核呈棕黄色者为阳性细胞。应用 ImagePro Plus 6.0专业图像分析软件测量TLR4阳性细胞表达的累积光密度值和NF-κB的阳性细胞率(%)。选择经免疫组化染色后的NF-κB切片，于低倍(40倍)显微镜下定位血肿周围脑组织区域，切换至高倍(400倍)显微镜下选取5个不重复视野进行拍照，采集图像后用Image Pro Plus6.0图像分析软件计算阳性细胞率；细胞核呈棕褐色为NF-κB表达阳性的细胞。

1.3.5 免疫印迹试验法检测TLR4和NF-κB蛋白的含量：过量麻醉(1%水合氯醛，剂量为0.35 mL/100 g)处死5只大鼠，断头取脑，取血肿周围脑组织，提取总蛋白，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，上样行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶后进行转膜，封闭(5%脱脂牛奶室温封闭1 h)，加入稀释好的一抗(TLR4为1 ∶1 000；NF-κB为1 ∶2 000；GAPDH为1 ∶10 000)，4℃冰箱中孵育过夜，用TBST洗3次，5 min/次，加稀释好的二抗(1 ∶10 000)，室温孵育2 h，最后用TBST在摇床上洗4次，5 min/次，根据不同的光强度调整曝光条件进行显影、定影。胶片采用AlphaEaseFC软件处理系统分析，以GAPDH作为内参，以目的条带的灰度值/GAPDH条带的灰度值为目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较依据方差齐性检验采用LSD-t法或Dunnett T3法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组大鼠Garcia 评分及脑组织含水量比较 假手术组、虾青素高剂量组、虾青素低剂量组、脑出血组的 Garcia 评分均依次降低，脑组织含水量依次增加(均P<0.05)，见表1。

表1 4组大鼠Garcia评分及脑组织含水量比较(x±s)

2.2 4组大鼠血肿周围脑组织TNF-α、IL-1β表达水平比较 假手术组、虾青素高剂量组、虾青素低剂量组、脑出血组TNF-α、IL-1β表达水平均依次增加(均P<0.05)，见表2。

表2 4组大鼠血肿周围脑组织TNF-α、IL-1β表达水平比较(x±s，pg/mg)

2.3 4组大鼠血肿周围脑组织TLR4、NF-κB蛋白的表达水平比较 免疫组织化学法及免疫印迹试验法检测结果均显示，假手术组、虾青素高剂量组、虾青素低剂量组、脑出血组TLR4、NF-κB蛋白的表达水平均依次增加(均P<0.05)，见图1及表3。

图1 免疫印迹试验法检测各组血肿周围脑组织中TLR4、NF-κB的蛋白表达

表3 4组大鼠血肿周围脑组织TLR4和NF-κB蛋白的表达水平比较(x±s)

3 讨 论

脑出血后，血肿周围脑组织的炎症反应是介导继发性损伤的主要病理机制，因此目前对脑出血后过度炎症反应的干预仍然是研究热点。炎症的发生机制涉及小胶质细胞的活化、炎性细胞的渗入、细胞因子和炎症趋化因子的释放，以上事件最终导致细胞死亡，从而加剧脑损伤。TLR4主要在小胶质细胞中表达，为一种模式识别受体[3]，在触发炎症通路中起重要作用：细胞外信号与小胶质细胞TLR4受体结合后诱导NF-κB活化，NF-κB激活后进入细胞核内与DNA结合，通过调控TNF-α、IL-1β等炎症因子的转录，使炎症介质过表达并最终形成炎症瀑布效应；而TNF-α、IL-1β等炎症因子同时又是NF-κB的激活剂，由此形成恶性循环，导致持久的炎性反应，进而加重脑水肿及神经细胞损伤[10-11]。因此，负性调控TLR4介导的炎症信号通路，是减轻脑出血后继发性炎症损伤的关键环节。

虾青素是一种重要的脂溶性类胡萝卜素，可通过血脑屏障，进而在中枢神经系统中发挥抗氧化、抗炎症、抗凋亡等作用。早在1999年，虾青素的食用安全性就已经得到了广泛的认可，其被美国食品药物管理局批准作为膳食添加剂[12]。大量研究表明，虾青素能明显减轻中枢神经系统损伤，发挥神经保护作用。例如，Zhang等[13]的研究结果表明，早期使用虾青素可以抑制蛛网膜下腔出血大鼠小胶质细胞的活化，抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活，减少促炎因子IL-1β、TNF-α、细胞间黏附分子1的表达，从而对早期脑损伤起改善作用。吴杰等[14]研究发现，虾青素可抑制炎症因子的表达，减少脑梗死体积，改善神经功能，发挥神经保护作用。还有研究表明，虾青素对脂多糖刺激下IPEC-J2细胞中炎症因子的表达有抑制作用，其对细胞的保护作用与TLR4/髓样分化因子88/NF-κB 信号通路相关[15]。此外，虾青素还被证实在脑梗死、蛛网膜下腔出血、脑外伤、脊髓损伤、帕金森综合征等疾病中具有神经保护作用[8,13,16-18]，但国内外有关虾青素对脑出血大鼠的神经保护作用研究报告较少。本研究观察虾青素对脑出血大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表达的影响，探讨其可能的脑保护机制。

本研究结果显示，假手术组、虾青素高剂量组、虾青素低剂量组、脑出血组Garcia评分依次降低，而脑组织含水量及血肿周围脑组织TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β的表达水平依次增加(均P<0.05)，与相关研究结果[13]相似，提示虾青素可能通过抑制脑出血大鼠TLR4、NF-κB蛋白的表达，从而下调炎症因子TNF-ɑ、IL-1β的表达，减轻炎症反应，发挥保护神经功能的作用，且其保护作用有剂量依赖性。

综上所述，虾青素对脑出血大鼠具有一定的神经保护作用，其作用机制可能为抑制血肿周围组织TLR4/NF-κB信号通路的激活，从而下调炎症因子TNF-ɑ、IL-1β的表达，从而减轻继发性炎症损伤及脑水肿。但虾青素脑保护作用的具体机制仍不清楚，且最佳使用剂量仍不确切，有待今后更深入的研究以明确。