反复呼吸道感染患儿外周血单个细胞中微小RNA-146a和微小RNA-155表达水平及其临床意义

杜 赢 牛焕红 马 科

(1 西安工会医院儿科，陕西省西安市 710100，电子邮箱：duying5405@sina.com；2 空军军医大学西京医院儿科，陕西省西安市 710032；3 延安大学附属医院儿科，陕西省延安市 716000)

反复呼吸道感染(recurrent respiratory tract infection，RRTI)是儿科常见的多发病，儿童RRTI的发病率在20%左右[1]，其可严重影响患儿身体发育和健康状况。RRTI病程长、易反复、易发生变态反应，且不易治愈，严重时可危及患儿心、肺、脑等重要器官。RRTI发病原因复杂，发病机制尚未完全清楚，营养不良、环境中病原微生物等因素均可能导致儿童发生RRTI[2]，而儿童机体免疫力下降、先天或后天免疫机制缺陷是RRTI发生的主要原因。微小RNA(micro RNA,miR)与机体免疫功能异常存在密切关系[3]。miR-146a、miR-155是目前颇受关注的两种miR亚型。其中miR-146a位于第5q34染色体上，已被证实参与多种免疫疾病的发生和发展，如强直性脊柱炎、类风湿性关节炎等[4]。miR-155在多种免疫细胞如T细胞、B细胞中被检测到有表达，被认为与多种炎症相关的因子和信号蛋白调控有关[5]。有研究结果显示，miR-146a、miR-155均与免疫反应和炎症过程密切相关，可参与部分免疫细胞的形成过程，在某些免疫性疾病中表达水平异常升高[6]。目前，关于miR-146a、miR-155的研究多围绕类风湿性关节炎等典型免疫性疾病开展，鲜有针对RRTI的研究。因此，本研究通过检测RRTI患儿外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中miR-146a、miR-155的表达水平，探讨RRTI与RRTI患儿机体炎症反应和免疫状态的关系，并评估miR-146a、miR-155对小儿RRTI的诊断价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年5月至2019年5月在西安工会医院儿科确诊为RRTI的100例患儿作为研究组，其中男性53例、女性47例，年龄2个月至13岁[(8.69±2.46)岁]，2个月≤年龄≤2岁20例，2岁<年龄≤5岁42例，5岁<年龄≤13岁38例。纳入标准：(1)符合《反复呼吸道感染的临床概念和处理原则》[7]中关于RRTI的判定标准。(2)年龄0～14周岁；(3)患儿两次感染间隔不少于8 d。排除标准：(1)合并先天性心脏病、先天性气道发育异常等患儿；(2)1个月之内服用过免疫调节剂、肾上腺激素者；(3)严重肝、肾、心、肺功能不全者；(4)不配合本研究者。选取同期在本院进行体检的100例健康儿童为对照组，其中男性51例、女性49例，年龄2个月至13岁[(8.58±2.72)岁]，2个月≤年龄≤2岁18例，2<年龄≤5岁45例，5岁<年龄≤13岁37例。研究组与对照组儿童的年龄、性别差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究经本院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得患者及家属知情同意并签字，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 主要试剂与仪器 TRI Reagent®BD RNA提取试剂盒购自美国Molecular Research Center公司(货号：TB126)；反转录试剂盒购自美国Sigma公司(货号K1622)；AceQ qPCR SYBR®Green Master Mix定量PCR反应试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(货号：Q221-01)；引物由上海生工生物公司设计合成；C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、IgG、IgA酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司(货号：ml057570、ml025149、ml025158)；IgM ELISA试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(货号：BMS2098)；CFX96型实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；ELX800型全自动酶标仪购自美国Bio-Tek公司；BC-5800型五分类血球分析仪购自中国迈瑞公司；日立7600全自动生化分析仪购自株式会社日立制作所。

1.3 样本采集 研究组患儿确诊次日采集空腹外周静脉血6 mL，对照组儿童于体检时采集空腹外周静脉血6 mL。立即取其中3 mL加入无菌肝素抗凝管(20 IU/mL)，下层血细胞用于提取PBMC，使用密度梯度离心法分离PBMC；余下3 mL在4℃条件下静置促凝，30 min后，3 000 r/min离心10 min，取血清，置于-80℃低温冷冻备用。

1.4 荧光定量PCR检测miR-146a、miR-155表达水平 根据试剂盒说明书，提取PBMC中的总RNA，并将其反转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR仪对miR-146a、miR-155进行扩增。PCR反应体系共10 μL：miScript SYBR®Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反应条件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；45个循环。miR-146a、miR-155及内参U6的引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法对血清miR-146a、miR-155表达水平进行定量分析。

表1 引物序列

1.5 感染指标、免疫指标检测 采用BC-5800型五分类血球分析仪检测白细胞计数；全自动生化分析仪测定患儿血清CRP、IgG、IgA、IgM水平，检测操作严格按照试剂盒说明书进行。为控制检测质量，本次研究所有样品的检测均由检验科同一批人员在同一台仪器上操作，每个样本均设3个复孔。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0进行统计分析。计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以(x±s)表示，组间比较采用两样本t检验或t′检验；相关性分析采用Pearson相关性检验；采用Logistic回归模型分析RRTI发病的影响因素；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析相关指标的诊断效能，应用正态z检验(MedCalc软件)对曲线下面积(area under the curve，AUC)进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组PBMC中miR-146a和miR-155表达水平的比较 研究组PBMC中miR-146a、miR-155的相对表达水平低于对照组(均P<0.05)，见表2。

表2 两组PBMC中miR-146a和miR-155相对表达水平的比较(x±s)

2.2 两组血清感染指标和体液免疫指标水平的比较 与对照组比较，研究组CRP水平、白细胞计数较高，而IgA、IgM、IgG水平较低(均P<0.05)，见表3。

表3 两组血清感染指标和体液免疫指标水平的比较(x±s)

2.3 RRTI患儿PBMC中miR-146a、miR-155相对表达水平与感染和免疫指标的相关性 RRTI患儿PBMC中miR-146a、miR-155相对表达水平与白细胞计数均呈负相关，而与IgA、IgM、IgG水平均呈正相关，且miR-146a与miR-155相对表达水平呈正相关(均P<0.05)，见表4。

表4 RRTI患儿PBMC中miR-146a、miR-155相对表达水平与感染和免疫指标的相关性

2.4 影响RRTI发生的危险因素 以血清IgA、IgM、IgG水平和PBMC中miR-146a、miR-155相对表达水平为自变量，以是否发生RRTI为因变量，进行多因素Logistic回归分析，变量赋值见表5，赋值时所取的分界值均为研究组各变量的平均值。结果显示，miR-146a、miR-155相对表达水平降低，以及IgA、IgM、IgG水平降低均是影响RRTI发生的危险因素(均P<0.05)，见表6。

表5 变量赋值情况

表6 影响RRTI发生的多因素Logistic回归分析结果

2.5 PBMC中miR-146a、miR-155相对表达水平对RRTI的诊断效能 PBMC中miR-146a相对表达水平诊断RRTI的AUC为0.826(95%CI：0.795～0.858；P<0.001)，截断值为1.675，灵敏度为80.60%，特异度为80.80%；PBMC中miR-155相对表达水平诊断RRTI的AUC为0.859(95%CI：0.829～0.889；P<0.001)，截断值为1.904，灵敏度为87.10%，特异度为85.00%；两者联合诊断RRTI的AUC为0.905(95%CI：0.880～0.930；P<0.001)，灵敏度为84.90%，特异度为91.20%。两者联合诊断RRTI的AUC均大于miR-146a、miR-155单独诊断(z=3.724，P<0.001；z=2.502，P=0.012)。见图1。

图1 miR-146a、miR-155相对表达水平以及二者联合诊断RRTI的ROC曲线

3 讨 论

RRTI是儿科临床常见病，与小儿机体免疫功能低下及免疫功能紊乱有密切关系。RRTI患儿在一定程度上会出现细胞免疫和体液免疫功能降低[8-9]。miR是一类含多个核苷酸的内源性非编码小RNA，其通过抑制靶基因的表达参与疾病的病理过程，在机体免疫中有着举足轻重的作用[10]。例如，周玉兰等[11]研究发现，在脊髓模型损伤大鼠血清中，miR-146可抑制白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8等炎症因子水平，从而显著减轻炎症反应[11]；哮喘患儿血清miR-155水平较对照组显著降低，且miR-155水平与血清炎症因子水平有关[12]。本研究中，RRTI患儿PBMC中miR-146a、miR-155相对表达水平低于健康儿童，且两者的相对表达水平呈正相关(P<0.05)；Logistic回归分析结果显示，miR-146a、miR-155相对表达水平降低均是RRTI发生的危险因素(均P<0.05)。这提示miR-146、miR-155异常表达与RRTI发生有关，两者可能共同参与调控RRTI的发病。

免疫球蛋白在体液免疫中有着举足轻重的地位，其特异性地与抗原结合并激活补体，进而对吞噬细胞介导的细胞毒作用加以调理，进一步发挥抗菌、抗病毒作用。王琦等[13]研究发现，与对照组比较，RRTI患儿血清IgG、IgA水平显著降低，炎症细胞因子IL-6水平显著升高。进一步证实体液免疫与细胞免疫紊乱参与RRTI病情的发生和发展。此外，研究表明CRP、白细胞计数等感染指标可以反映呼吸道感染疾病的病情严重程度和转归情况[14]。本研究结果显示，与对照组比较，研究组CRP水平、白细胞计数较高，免疫球蛋白IgA、IgM、IgG水平较低(P<0.05)，与上述文献报告的结果相似；同时，RRTI患儿PBMC中miR-146a、miR-155相对表达水平与白细胞计数均呈负相关，与血清IgA、IgM、IgG呈正相关(均P<0.05)。由此推测miR-146a、miR-155表达水平的降低，可能促使细胞炎症因子如IL-6的表达增加而使机体炎症损伤严重，进一步促使细胞免疫功能降低和体液免疫功能紊乱，导致RRTI的发生。

我们进一步行ROC曲线分析发现，RRTI患者PBMC中的miR-146a、miR-155的相对表达水平对RRTI具有一定的诊断效能，两者联合诊断RRTI的曲线下面积达0.905，高于单一指标单独诊断，且灵敏度为84.90%，特异度为91.20%。这提示外周血PBMC中的miR-146a、miR-155水平均可用于RRTI的诊断，以筛查疑似RRTI患儿，而两者联合检测时可进一步提高诊断效能。

综上所述，RRTI患儿外周血PBMC中miR-146a、miR-155的表达水平显著降低，两者可能共同参与免疫炎症调控过程，进而导致RRTI的发生，两者联合检测对小儿RRTI诊断有一定临床价值。本研究不足之处在于取样均来自同一医院，样品来源具有单一性，且样本量较少，因此计划下一步扩大样本来源和范围进行深入研究。