石蜡切片的保存条件对免疫组化反应活性的影响

高丽丽，章宜芬，钱金林，苏红丹，李林秋，李 青

免疫组化染色技术是一种多步骤、多因素决定的实验方法，染色过程中存在很多干扰因素[1]。组织如何保存是形态学研究的主要问题。生物样本若冷冻或低温储存，可保存多年。用固定液浸泡标本是病理实验室最常用的组织保存方法，组织固定后，石蜡包埋也可保存多年。包埋后的石蜡组织通常在行免疫组化染色前1～2天切片。实际工作中有时因组织太小不易再次切片；或者病理、科研工作中用的组织对照片会提前切片，存放太久的切片对组织抗原的影响尚未可知。有学者建议不要使用存放太久的切片进行染色，但是“太久”的定义并不明确。最近研究发现[2]，室温下保存组织切片，ER和PR表达强度均明显降低。本实验用4种抗体在室温、4 ℃、-20 ℃条件下对保存2～6个月的未染色切片进行免疫组化检测，比较组织切片保存温度及时间对免疫组化染色结果的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料羊膜卷组织(包含乳腺癌和阑尾组织)连续切片180张，羊膜卷组织的制作参考文献[3]。

1.2 方法对180张组织切片进行编号(常温1～60号，4 ℃ 1～60号，-20 ℃ 1～60号)，分为三组，并按不同温度保存，每2个月分别抽取三组切片进行Ki-67、CKpan、GATA-3、desmin免疫组化染色。免疫组化染色均在Dako Link48全自动免疫组化仪上操作。

1.3 结果判定所有切片均经资深病理医师进行阅片，每张切片在高倍镜(40×)下观察10个不同视野，每个视野计数100个细胞。Ki-67、GATA-3定位于细胞核，CKpan、desmin定位于细胞质。Ki-67阳性判定标准参照2018年《美国临床肿瘤学会/美国病理学家协会乳腺癌激素受体免疫组织化学检测指南》。Ki-67以≤20%为低表达，>20%为高表达[4]。GATA-3、CKpan和desmin染色计分：(1)按阳性细胞数所占百分比计分：阳性细胞数0～10%为0分、11%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、76%～100%为4分。(2)按染色强度计分：无着色为0分、浅棕黄色为1分、棕黄色为2分、深棕黄色为3分。将两项得分结果相乘：0～4分为低表达，6～12分为高表达[5]。

2 结果

2.1 切片的免疫组化染色把提前切取的组织片按组别分别在新鲜组织和保存2、4和6个月后组织进行4种抗体的免疫组化染色(图1)。染色结果显示：Ki-67、GATA-3和desmin在室温和4 ℃保存均在6个月后出现染色强度降低的现象，-20 ℃保存条件下染色强度一致；CKpan在4 ℃保存6个月后出现染色强度降低的现象，在室温和-20 ℃保存条件下染色均一致。

图1 乳腺癌组织中Ki-67的免疫组化染色，EnVision法：A.室温保存6个月后的切片染色；B.-4 ℃保存6个月后的切片染色；C.-20 ℃保存6个月后的切片染色；D.新鲜切片染色

2.2 Ki-67、CKpan、GATA-3、desmin抗体的染色分类Ki-67：常温和4 ℃保存6个月后的切片表达强度均由之前的8分降为4分。GATA-3：常温和4 ℃保存6个月后的切片表达强度均由之前的12分降为6分。desmin：常温和4 ℃保存6个月后的切片表达强度由之前的9分降为6分，而-20 ℃保存6个月后的切片表达强度与之前一致。CKpan：4 ℃保存6个月后的切片表达强度由之前的12分降为8分，常温和-20 ℃保存6个月后的切片表达强度与之前一致(表1)。

表1 Ki-67、CKpan、GATA-3、desmin抗体的表达强度比较

3 讨论

有研究[6]发现乳腺癌组织切片保存12周后其中p53免疫反应活性明显下降，认为抗原和组织的保存条件可能是免疫染色结果改变的潜在原因。林兴滔等[2]也比较过ER、PR和HER-2在切片保存2年后组织抗原反应活性的变化。本组实验增加了时间梯度，切片保存2、4、6个月后对病理科常用的4种抗体进行检测，因为在临床病理工作中这4种抗体在判断肿瘤来源和细胞增殖活性方面使用频率较高。

本实验发现，切片保存的时间和温度会导致组织抗原丢失，影响免疫组化染色结果，导致假阴性现象。对于核表达(如Ki-67和GATA-3)的抗体更易发生抗原丢失，4 ℃和常温保存6个月后的切片出现明显的染色强度降低。胞质表达的抗体(desmin)也较易受时间和温度的影响。但是CKpan 4 ℃保存比常温保存更易发生抗原丢失，推测可能与CKpan蛋白表达模式或者组织内源性/外源性水分相关。Xie等[7]研究发现环境中湿度也会影响抗原的保存，室温下的干燥贮藏条件优于冷藏条件下的潮湿贮藏条件。因此，本实验认为低温干燥的环境有利于切片抗原的保存。

抗原反应活性降低常发生在石蜡切片上，并未发生(或在一个非常低的水平)在组织蜡块中。提示切片暴露于空气中可能与抗原改变有关。唐锦玲等[8]报道石蜡组织块保存时间对细胞质表达定位抗原的影响轻微。

用于病理诊断的免疫组化染色通常在保存1～2天的新鲜切片上进行。然而，对于会诊病例或科研工作，抗原改变可能是一个真正的问题。通常情况下，病理科会诊切片一般是外借组织切片，尤其国外会诊，切片邮寄时间过久，如p53，仅保存几周就可能引起抗原的改变[6]。因此我们应重视切片保存对免疫组化染色的影响。

当无法避免使用长期保存的切片时，作者建议实验人员应首先证明抗原反应活性是否有效，即长期保存的切片与最近切片染色结果是否一致。其次，探究组织切片抗原最佳保存条件。

由于本实验样本量少，仅检测了保存6个月内的切片，后续需增加样本量，继续观察；抗原反应活性还可能取决于组织类型或者抗原的氧化，在后续实验中可增加组织类型或者密闭保存减少切片在空气中的暴露，进一步分析原因；另外应考虑水分对抗原活性的影响。总之，要提高免疫组化染色技术，不但要注意标本的固定、切片、染色等环节的规范操作，而且还要在实际工作中不断摸索，完善免疫组化技术，只有这样才能更好地解决实际工作中的问题，为病理诊断提供有力的技术保障。